食管鱗癌細(xì)胞及VEGF-C siRNA對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及成環(huán)能力的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景:
  食管癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重危害人類生命與健康的惡性腫瘤之一,我國(guó)的食管癌的發(fā)病率高居世界首位,尤其是在太行山脈附近的省份明顯高發(fā)。淋巴道轉(zhuǎn)移是食管癌早期轉(zhuǎn)移的重要途徑,同時(shí)也是惡性腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的主要原因。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞作為淋巴管最基本的單元,是食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移的重要界面。
  不同分化程度的食管癌的轉(zhuǎn)移力和侵襲力是不同的,促進(jìn)其相關(guān)淋巴管的生成能力也是不同的。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控因子有多種,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

2、子VEGF-C是目前公認(rèn)的淋巴管生成的主要調(diào)控因子,可以與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3結(jié)合,誘導(dǎo)VEGFR-3發(fā)生酪氨酸激酶磷酸化,促進(jìn)惡性腫瘤內(nèi)淋巴管生成,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵入周圍淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處擴(kuò)散。而Endostatin是一種很強(qiáng)的血管生成抑制因子,能夠抑制淋巴管生長(zhǎng)因子VEGF-C的作用,在體外強(qiáng)烈的抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和游走,并明顯地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,還可以誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,從而抑制了腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移。

3、>  本課題采用不同分化程度的食管鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液三維培養(yǎng)食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察其對(duì)食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及成環(huán)能力韻影響;構(gòu)建針對(duì)VEGF-C的慢病毒載體或pSINsi-U6-siRNA真核表達(dá)載體及應(yīng)用endostatin分別處理不同分化程度的食管鱗癌細(xì)胞后,取其培養(yǎng)上清液再處理食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察對(duì)食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞體外成環(huán)能力及增殖的影響,探討腫瘤源性微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與食管鱗癌細(xì)胞間的相

4、互作用及其可能機(jī)制,為進(jìn)一步探討食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制及其阻斷研究提供理論依據(jù)。
  目的:
  研究不同分化程度的食管鱗癌細(xì)胞系細(xì)胞對(duì)腫瘤微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞體外成環(huán)及增殖的影響;研究VEGF-CsiRNA真核表達(dá)載體及endostatin對(duì)食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞體外成管能力及增殖的影響。
  方法:
  1.采用免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot方法檢測(cè)食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR-3、LYVE-1

5、、Podoplanin、Prox-1蛋白的表達(dá);采用原位雜交方法檢測(cè)食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、 Prox-1mRNA的表達(dá);
  2.培養(yǎng)高分化食管鱗癌EC9706細(xì)胞及低分化食管鱗癌KYSE150細(xì)胞,收集其無(wú)血清培養(yǎng)基上清,作為食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基;分組三維培養(yǎng)食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞:E1組加入EC9706條件培養(yǎng)基,E2組加入KYSE150條件培養(yǎng)基,K組

6、不更換培養(yǎng)基。計(jì)數(shù)三組細(xì)胞形成的管樣結(jié)構(gòu)。消化各組細(xì)胞,采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
  3.構(gòu)建慢病毒載體和真核表達(dá)載體,進(jìn)行侵/轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià),選擇最優(yōu)方式。針對(duì)人源VEGF-C設(shè)計(jì)3條干擾序列SG0、SG1、SG2,并篩選出最佳干擾序列。
  4.內(nèi)皮素抑制試驗(yàn):用不同濃度的endostatin處理EC9706細(xì)胞和KYSE150細(xì)胞,采用CCK-8方法選取最佳抑制濃度。
  5.將EC9706細(xì)胞和KYS

7、E150細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和endostatin處理,并制備條件培養(yǎng)基。分組如下:空白對(duì)照組:未轉(zhuǎn)染的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。SG1組:轉(zhuǎn)染SG1質(zhì)粒的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。SG2組:轉(zhuǎn)染SG2質(zhì)粒的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。內(nèi)皮抑素組:最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。陰性+內(nèi)皮抑素組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。SG1+內(nèi)抑皮素組:轉(zhuǎn)染SG

8、1后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。SG2+內(nèi)抑皮素組:轉(zhuǎn)染SG2后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基
  6.按照上述分組三維培養(yǎng)食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)數(shù)各組細(xì)胞形成的管樣結(jié)構(gòu)。消化各組細(xì)胞,運(yùn)用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
  7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理,計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析,多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
  結(jié)果:

9、
  1.免疫細(xì)胞化學(xué)、Western Blot及原位雜交檢查結(jié)果顯示:VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1蛋白及mRNA在食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)。
  2.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示:在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成環(huán)的數(shù)目E1組>E2組>K組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);隨著時(shí)間的延長(zhǎng),E1組和E2組的成環(huán)數(shù)均有不同程度的減少。
  3.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果:三組細(xì)

10、胞的增值情況為E1組>E2組>K組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
  4.侵/轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)結(jié)果:KYSE150細(xì)胞侵染效率為90%以上,轉(zhuǎn)染效率為70%左右,可以進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn);EC9706細(xì)胞侵染效率約為30%左右,轉(zhuǎn)染效率約為50%左右,達(dá)不到下游實(shí)驗(yàn)要求。在此,選擇質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
  5.質(zhì)粒篩選結(jié)果:轉(zhuǎn)染后,EC9706和KYSE150細(xì)胞中SG1和SG2中VEGF-C蛋白的表達(dá)量明顯低于其他各組,即SG

11、1和SG2的抑制效果均優(yōu)于其他組。
  6.三維培養(yǎng)結(jié)果:
  6.1 EC9706細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組細(xì)胞的成環(huán)結(jié)果中,空白對(duì)照組>陰性對(duì)照組>內(nèi)皮抑素組>陰性+內(nèi)皮抑素組>SG2組>SG1組>SG2+內(nèi)皮抑素組>SG1+內(nèi)皮抑素組,其中兩對(duì)照組之間比較,SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SG1組、SG2組、內(nèi)皮抑素組、陰性+內(nèi)皮抑素組分別兩兩比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(P>0.05)。余各組兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
  6.2 KYSE150細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組細(xì)胞的成環(huán)結(jié)果中,總體上比較,陰性對(duì)照組>空白對(duì)照組>NC+內(nèi)皮抑素組>內(nèi)皮抑素組> SG2組>SG1組>SG1+內(nèi)皮抑素組>SG2+內(nèi)皮抑素組,其中兩對(duì)照組之間比較,SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);SG1組、SG2組、內(nèi)皮抑素組、NC+內(nèi)皮抑素組分別

13、兩兩比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);余各組兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
  6.3將EC9706細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組進(jìn)行比較,經(jīng)過(guò)處理后的KYSE150細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的成環(huán)數(shù)高于EC9706細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
  7.CCK-8結(jié)果:
  7.1在EC9706細(xì)胞收取的條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)后各

14、組細(xì)胞的增殖情況中,各組活細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組>陰性對(duì)照組>內(nèi)皮抑素組>陰性+內(nèi)皮抑素組> SG2組> SG1組>SG1+內(nèi)皮抑素組>SG2+內(nèi)皮抑素組,SG2組和內(nèi)皮抑素組比較,SG2組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較,內(nèi)皮抑素組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較,SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。余各組進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
  7.2在KYSE150細(xì)胞收取的條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)

15、后各組細(xì)胞的增殖情況中,各組活細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組>陰性對(duì)照組>內(nèi)皮抑素組> SG2組>SG1組>陰性+內(nèi)皮抑素組>SG1+內(nèi)皮抑素組>SG2+內(nèi)皮抑素組,兩對(duì)照組比較,SG1組和SG2組比較,SG1組和內(nèi)皮抑素組比較,SG1組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較,SG2組和內(nèi)皮抑素組比較,SG2組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較,SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。余各組進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<

16、br>  7.3將EC9706細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細(xì)胞收取條件培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)的各組進(jìn)行比較,經(jīng)過(guò)處理后的KYSE150細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖量高于EC9706細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
  結(jié)論:
  1、不同分化程度的食管癌細(xì)胞均可促進(jìn)食管癌微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的體外成環(huán)及增殖能力,低分化食管癌細(xì)胞效應(yīng)更為明顯。
  2、VEGF-C siRNA及endostat

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