血管內(nèi)皮抑制因子Endostatin和PF-4對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生成的影響.pdf

1、目的淋巴管生成(lymphangiogenesis)為既存淋巴管的新淋巴管的生成.它參與體內(nèi)許多生理和病理過(guò)程,如胚胎發(fā)育、器官移植、傷口愈合、組織和器官再生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等.本研究的目的在于尋找安全、有效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的淋巴管生成抑制劑,從而抑制腫瘤局部淋巴管的新生,阻斷腫瘤淋巴管的轉(zhuǎn)移途徑.材料和方法在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)取新鮮豬的胸導(dǎo)管保鮮運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,從其遠(yuǎn)端找到淋巴結(jié)并注入1％的膀氨天藍(lán)顯示胸導(dǎo)管,解剖出10~15cm胸導(dǎo)管,仔細(xì)去除表

2、面的脂肪,從遠(yuǎn)端插入靜脈套針,用D-Hanks液沖洗腔內(nèi)殘留的淋巴液和膀氨天藍(lán),再經(jīng)遠(yuǎn)端注入膠原酶(1mg/ml),使胸導(dǎo)管保持充盈.37℃消化10分鐘后,收集消化液并用培養(yǎng)液沖洗胸導(dǎo)管,收集消化液離心(1000r/min),去除上清夜,用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種到培養(yǎng)皿中.然后將其置于37℃、5%C02和95%的空氣條件下培養(yǎng),2~3天更換一次培養(yǎng)液.當(dāng)細(xì)胞融合至單層時(shí),用0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA消化和傳代培養(yǎng).淋巴管

3、內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定是通過(guò)抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體免疫熒光染色、普通光鏡和電子顯微鏡觀察聯(lián)合進(jìn)行的.當(dāng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層時(shí),消化傳代、平均等份分到四個(gè)培養(yǎng)皿中,然后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).細(xì)胞匯合后,用無(wú)菌刀片在培養(yǎng)皿的生長(zhǎng)面刮一條直線,而后用細(xì)胞塑料刮子將直線一側(cè)的細(xì)胞完全刮除,并用D-Hanks液沖洗刮除的細(xì)胞.將含有不同濃度抑制因子的培養(yǎng)液加入上述培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí),然后測(cè)量細(xì)胞向刮除區(qū)遷移的距離并對(duì)刮除區(qū)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以此

4、來(lái)判定抑制因子對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和游走有無(wú)抑制作用.該實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)皮細(xì)胞為第2~3代細(xì)胞,選擇的抑制因子為Endostatin和PF-4,設(shè)立對(duì)照組、Endostatin實(shí)驗(yàn)組和PF-4實(shí)驗(yàn)組.其中Endostatin實(shí)驗(yàn)組包括濃度為50 ng/ml、100ng/ml、150 ng/ml三組;PF-4實(shí)驗(yàn)組包括濃度為40 ng/ml、80 ng/ml、120 ng/ml三組.運(yùn)用Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果用平均數(shù)