人和小鼠睪丸特異性表達(dá)基因譜分析.pdf

1、本研究通過(guò)比較小鼠4、9、18、35、54日齡和6月齡小鼠睪丸，人胚胎期和成人睪丸的Affymetrix芯片分析的全基因組表達(dá)及差異基因表達(dá)譜，篩選出人睪丸差異表達(dá)3018個(gè)基因，小鼠不同日齡睪丸差異表達(dá)2058個(gè)基因，小鼠差異表達(dá)的基因主要出現(xiàn)在9日齡與18日齡、18日齡與38日齡兩組睪丸組織中。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件Cluster 3.0做2058個(gè)基因的聚類(lèi)分析(HierarchicalClustering)，將2058個(gè)基因分為8個(gè)

2、大類(lèi)。第1類(lèi)411個(gè)基因，如CREM,Testisin,MSJ-1,TPAP,Soggy,Hox a4和mTSARG3；第Ⅱ類(lèi)76個(gè)基因，如CATSPER2和Pgk-2；第Ⅲ類(lèi)453個(gè)基因，如Tnp2,HILs1,SP-10，SPArA6,Ddc8和TESF-1第Ⅳ類(lèi)112個(gè)基因，如SRG4;第Ⅴ類(lèi)87個(gè)基因，如RFX2；第Ⅵ類(lèi)548個(gè)基因，如Tesmin,GRTH,Trif，等。第Ⅶ類(lèi)362個(gè)基因；第Ⅷ類(lèi)9個(gè)基因。2058個(gè)基因進(jìn)行功

3、能分類(lèi)。按生物學(xué)途徑(Biological process)分：生理(Physiological)434個(gè)基因；細(xì)胞途徑(Cellular process)241個(gè)基因；發(fā)育fDevelopment)82個(gè)基因；未知途徑(Unknown process)52個(gè)基因；調(diào)節(jié)(Regulation)6個(gè)基因，行為(Behavior)5個(gè)基因，不能分類(lèi)的(Unclassifiedes)1151個(gè)基因。按分子功能(Molecular functi

4、on)分：結(jié)合(Binding)344個(gè)基因；催化活性(Catalytic activity)250個(gè)基因；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(Signal transducer)68個(gè)；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Transporter)62個(gè)；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(Transcription regulator)53個(gè)；未知功能的48個(gè)基因；結(jié)構(gòu)分子(Structure molecule)25個(gè)；分子伴侶(Chaperone)22個(gè)；酶調(diào)節(jié)因子(Enzyme regulator)

5、22個(gè)；運(yùn)動(dòng)活性(Motor activity)15個(gè)；抗氧化劑活性(Antioxidant activity)3個(gè)；翻譯調(diào)節(jié)蛋白(Translation regulator)3個(gè)；有1439個(gè)基因不能被分類(lèi)。按細(xì)胞組分(Cellular component)分：在2058個(gè)基因中，411個(gè)基因在細(xì)胞上表達(dá)，124個(gè)基因在細(xì)胞外表達(dá)，未知組分43個(gè)，沒(méi)定位的6個(gè)，還有1 544個(gè)基因不能被分類(lèi)。 從2058個(gè)基因中隨機(jī)選擇了10

6、個(gè)基因，做半定量RT-PCR分析。不同日齡的Balb/C小鼠睪丸內(nèi)，這類(lèi)基因在早期睪丸中不表達(dá)或表達(dá)很弱，隨著年齡的增長(zhǎng)，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了Affymetrix芯片數(shù)據(jù)的可靠性。根據(jù)小鼠睪丸組織芯片分析數(shù)據(jù)，結(jié)合半定量RT-PCR，篩選出8個(gè)新的小鼠睪丸特異性基因(Testis-specific conserved gene，TSC)，按照它們的分子量和生物學(xué)活性分別命名為T(mén)SC21、TSC23、TSC24、T

7、SC28、TSC31、TSC77、睪丸特異性BAG(Bcl-2 associated athanogene)樣蛋白(Testis-specific BAG-like protein，TSBAG)和睪丸特異性Ⅱ型cAMP依賴(lài)性蛋白激酶錨定蛋白(Testis-specificanchoringprotein oftype Ⅱ cAMP-dependentproteinkinase，TSCPA)。采用小鼠和.人同源基因比較分析，找到相應(yīng)的人體

8、同源基因，經(jīng)RT-PCR鑒定，這8個(gè)基因也是人體睪丸組織特異性基因。小鼠TSC24(mTSC24,GenBank登錄號(hào)：AK006825)基因定位于1號(hào)染色體，其cDNA長(zhǎng)度899bp，開(kāi)放閱讀框624 bp，編碼一個(gè)207個(gè)氨基酸，分子量為23.997kDa。生物信息學(xué)分析表明該蛋白可能定位于細(xì)胞核中(60.9％)。該基因在小鼠睪丸組織的表達(dá)呈年齡依賴(lài)性升高，而且為睪丸組織特異性表達(dá)。Blast同源比較分析，mTSC24蛋白與黃牛(B

9、os Taurus)TSC24蛋白有57％的同源性，與黑猩猩(Chimpanzee)TSC24蛋白有60％的同源性，與狗(Canis familiaris)TSC24蛋白有40％的同源性，與人hTSC24蛋白有56％的同源性。 人TSC24基因(hTSC24，GenBank登錄號(hào)：NM_032126)，開(kāi)放閱讀框702bp，編碼一個(gè)有233個(gè)氨基酸、分子量為26.533 kDa的蛋白質(zhì)。RT-PCR證實(shí)該基因?yàn)槿梭w睪丸組織特異性

10、表達(dá)。將hTSC24基因的編碼序列插入真核表達(dá)載體DEGFP-C1上EGFP基因表達(dá)序列的3’端，構(gòu)建成攜帶GFP-TSC24融合基因表達(dá)盒的重組載體pEGFP-C1-GFP-TSC24，運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofactamine 2000將DEGFP-C1-GFP-TSC24轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，可見(jiàn)GFP-TSC24融合蛋白分布于細(xì)胞核，表明TSC24蛋白與TSC21相似，也定位于細(xì)胞核上。該研究結(jié)果發(fā)表在SCI收錄的國(guó)際期刊《Biolog

11、ical＆Pharmaceutical Bulletin》2006年第11期(PMID：17077512)。 小鼠TSC21(mTSC21，GenBank登錄號(hào)：AK005862)基因定位于染色體6C3位點(diǎn)，其cDNA長(zhǎng)度810 bp，開(kāi)放閱讀框543 bp，編碼一個(gè)180個(gè)氨基酸，分子量為21.04 kDa的蛋白質(zhì)，生物信息學(xué)分析表明該蛋白可能定位于細(xì)胞核中。該基因?yàn)樾∈蟛G丸組織特異性表達(dá)，且呈年齡依賴(lài)性升高。Blast同源比

12、較分析，小鼠mTSC21蛋白與大鼠TSC21蛋白有86％的同源性，與人hTSC21蛋白有70％的同源性。人TSC21基因(hTSC21，15niGene Hs.132104)定位于人染色體2p11-2位點(diǎn)，其cDNA長(zhǎng)度797 bp，開(kāi)放閱讀框542bp，編碼一個(gè)由180個(gè)氨基酸組成、分子量為20.61 kDa的蛋白質(zhì)。RT-PCR證實(shí)該基因?yàn)槿梭w睪丸組織特異性表達(dá)。將hTSC21，基因的編碼序列插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1上EGF

13、P基因表達(dá)序列的3’端，構(gòu)建攜帶GFP-TSC21融合基因表達(dá)盒的重組載體pEGFP-C1-GFP-TSC21，運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofactamine 2000將pEGFP-C1-GFP.TSC21轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，可見(jiàn)GFP-TSC21融合蛋白分布于細(xì)胞核，表明TSC21蛋白定位于細(xì)胞核上。上述研究結(jié)果于2006年發(fā)表在SCI收錄的國(guó)際期刊《Molecular Biology Report》(PMID：17091336)。采用RT-P

14、CR的方法，檢測(cè)8個(gè)睪丸表達(dá)特異性新基因TSC21、TSC23、TSC24、TSC28、TSC31、TSC77、TSBAG和TSCPA在正常人、隱睪癥和無(wú)精子癥患者睪丸組織的表達(dá)。與正常睪丸組織比較，TSC21、TSC23、TSC24、TSC28、TSBAG和TSCPA在隱睪癥和無(wú)精子癥患者睪丸組織的表達(dá)消失，TSC31的表達(dá)明顯減少，而TSC77的表達(dá)與正常睪丸組織無(wú)顯著差異。該結(jié)果表明，TSC21、TSC23、TSC24、TSC28

15、、TSC31、TSBAG和TSCPA在精子發(fā)生的過(guò)程中具有重要作用，這些基因的表達(dá)異?？赡芘c隱睪癥或無(wú)精子癥的發(fā)生有關(guān)。 篩選和鑒定精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用的睪丸特異性基因，并對(duì)這些基因的表達(dá)特性及其在精子發(fā)生過(guò)程中所起的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究，對(duì)理解精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育、了解男性性功能衰退、研制男性避孕藥及保健藥等具有重要意義。上述研究結(jié)果，無(wú)疑為進(jìn)一步研究這些睪丸特異性基因的生物學(xué)功能打下了良