胸腺素β4表皮特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的研究.pdf

1、胸腺素β4(Thymosinbeta4，Tβ4)是肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽家族的一員，具有促進(jìn)毛囊發(fā)育，加快毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。為了深入了解Tβ4基因?qū)γ野l(fā)育與毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，本研究構(gòu)建了表皮特異性表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞，驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)能力。通過(guò)原核注射技術(shù)，制作轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠，得到PCR陽(yáng)性小鼠，并檢測(cè)陽(yáng)性小鼠尾尖Tβ4基因mRNA水平的表達(dá)量。
　　 1.表皮特異性表達(dá)載體pODsRed-KTP和pCD

2、sRed-KTP的構(gòu)建
　　 本研究構(gòu)建了2個(gè)表皮特異性表達(dá)載體：pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP。pODsRed-KTP以角蛋白14啟動(dòng)子(keratin14promoter，pKRT14)指導(dǎo)Tβ4基因的表達(dá)，并以O(shè)ct-4啟動(dòng)子(Oct-4promoter，pOct-4)指導(dǎo)紅色熒光蛋白的表達(dá)。作為對(duì)照載體，pCDsRed-KTP以pKRT14指導(dǎo)Tβ4基因的表達(dá)，以CMV啟動(dòng)子(CMVpromoter，pC

3、MV)指導(dǎo)紅色熒光蛋白的表達(dá)。
　　 pKRT14是表皮特異性啟動(dòng)子，指導(dǎo)Tβ4基因在表皮類細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，使得pODsRed-KTP與pCDsRed-KTP具有表皮特異性。pODsRed-KTP與pCDsRed-KTP區(qū)別在于pODsRed-KTP的紅色熒光蛋白只在部分干細(xì)胞中表達(dá)，可以對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤，而pCDsRed-KTP的紅色熒光蛋白在大量細(xì)胞系中均表達(dá)，主要在后續(xù)試驗(yàn)中為pODsRed-KTP做對(duì)照。
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4、.轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞驗(yàn)證pKRT14功能
　　 將表皮特異性表達(dá)載體pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP轉(zhuǎn)入阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞。以表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)pCDsRed-KTP細(xì)胞為對(duì)照，推測(cè)pODsRed-KTP的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，約為31％。篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Tβ4基因的細(xì)胞，檢測(cè)Tβ4基因在mRNA水平的表達(dá)情況，與未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比，表達(dá)量上調(diào)了4.51倍。結(jié)果表明，pKRT14是有效的，能夠

5、啟動(dòng)Tβ4基因的表達(dá)。
　　 3.轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠的制備與鑒定
　　 通過(guò)原核注射技術(shù)得到50只待檢測(cè)幼鼠，經(jīng)過(guò)PCR鑒定得到4只陽(yáng)性小鼠，包括1只公鼠和3只母鼠，陽(yáng)性小鼠得率為8％。檢測(cè)Tβ4基因在陽(yáng)性小鼠尾尖mRNA水平的表達(dá)量，與正常小鼠比較，陽(yáng)性小鼠的mRNA水平的表達(dá)量介于1.32-2.05倍之間。
　　 本研究制作并初步鑒定了轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠，為進(jìn)一步研究Tβ4基因的功能，探索其作用機(jī)制等相關(guān)研究奠定