Subfatin脂肪特異性過表達(dá)小鼠模型的構(gòu)建及胰島素敏感性研究.pdf

1、人們很早就知道脂肪組織是人體最大的儲能器官，隨著上個世紀(jì)九十年代Leptin（瘦素）的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸意識到脂肪組織也是一個高度活躍的內(nèi)分泌器官，它能分泌各種生物活性肽或蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為脂肪因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體許多重要的病理生理過程。
　　由于肥胖已成為全球性健康問題，是許多重要疾病的主要危險因子，而體內(nèi)脂肪組織過多又是肥胖患者的重要特點之一，因此，了解脂肪因子與肥胖的關(guān)系，探索脂肪因子的具體生理功能，對治療肥胖產(chǎn)生的病理學(xué)后果是非常有

2、價值的。目前，人們對于脂肪因子的研究已取得許多重要進(jìn)展，比如有學(xué)者提出用Leptin或Leptin聯(lián)合低劑量胰島素治療糖尿病，有助于維持血糖穩(wěn)態(tài);前期大量研究證明Visfatin可以作為治療腦卒中的新靶點，等等。
　　在過去二十年間，不斷有新的脂肪因子被發(fā)現(xiàn)，目前科學(xué)界大概報道了超過100種脂肪因子。本室于2008年首次利用限食模型找到了一個新的脂肪因子，取名為Subfatin。
　　本室前期的初步試驗結(jié)果表明:Subfat

3、in在白色脂肪組織表達(dá)較高，其在限食大鼠的白色脂肪組織中表達(dá)下調(diào)，而在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠白色脂肪組織中表達(dá)上調(diào)，在脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸升高。據(jù)此我們認(rèn)為，Subfatin可能參與脂肪功能的調(diào)節(jié)，并影響肥胖及機(jī)體代謝。
　　制備脂肪細(xì)胞特異性過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物模型，是研究脂肪因子整體功能的可靠手段之一。為了研究脂肪細(xì)胞來源的Subfatin對脂肪組織生物學(xué)及代謝功能的影響，本課題構(gòu)建了Subfatin脂肪特異性過表達(dá)小鼠模

4、型，并對該小鼠模型的胰島素敏感性進(jìn)行了探索。
　　實驗方法:
　　1.pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒的構(gòu)建
　　(1)利用pIRES-EGFP-Subfatin質(zhì)粒PCR擴(kuò)增獲得Subfatin cDNA-his6，并將其插入pBS aP2 promoter(5.4 kb) polyA質(zhì)粒，構(gòu)建了pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒，即Subfatin脂

5、肪組織特異性過表達(dá)載體。
　　(2)對pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒進(jìn)行基因測序。
　　2.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　(1)將線性化的載體片段（含aP2 promoter、Subfatin cDNA-his6、Poly A）顯微注射進(jìn)C57BL/6小鼠的受精卵中。
　　(2)將受精卵移植入C57BL/6假孕母鼠的輸卵管壺腹部，監(jiān)護(hù)假孕母鼠生產(chǎn)，鑒定F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型。

6、　　(3)選出陽性首建鼠，與C57BL/6小鼠回交，獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠，鑒定基因型。
　　3.轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)驗證
　　(1)應(yīng)用半定量RT-PCR、Real-time PCR的方法檢測Subfatin基因的轉(zhuǎn)錄情況。
　　(2)應(yīng)用免疫組化的方法檢測脂肪組織Subfatin蛋白的表達(dá)情況。
　　(3)用ELISA測定血清中Subfatin蛋白的濃度。
　　4.轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性研究
　　(1

7、)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠的體重、食量進(jìn)行稱重。
　　(2)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實驗(GTT)。
　　(3)在高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行胰島素耐量實驗(ITT)。
　　(4)在高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行高胰島素性正糖(HIEG)鉗夾實驗。
　　結(jié)果:
　　1.基因測序結(jié)果表明，pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒上aP2 P

8、romoter-Subfatin區(qū)域的核苷酸序列分別與小鼠aP2 Promoter基因核苷酸序列及SubfatinmRNA編碼序列一致。說明Subfatin脂肪組織特異性過表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.對假孕母鼠產(chǎn)下的F0代轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型鑒定，得到四只陽性首建鼠。
　　3.半定量RT-PCR結(jié)果表明，在所取的腦組織、腎組織、心臟組織、肌肉組織、棕色脂肪組織和白色脂肪組織中，外源性Subfatin(Subfatin-his

9、6)只有在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中是過表達(dá)的。
　　4.Real-time PCR結(jié)果表明，Subfatin在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中的轉(zhuǎn)錄水平大大高于野生型小鼠，說明轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達(dá)的。
　　5.免疫組化的結(jié)果表明，Subfatin蛋白在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠白色脂肪組織中的表達(dá)明顯高于野生型小鼠，同樣說明轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達(dá)的。
　　6.ELISA的結(jié)果表明，Subf

10、atin蛋白在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的濃度的確高于野生型小鼠，該結(jié)果與Subfatin蛋白的分泌性質(zhì)相符合，同時也驗證了其在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)是過表達(dá)的。
　　7.在正常飲食或高脂飲食飼養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的體重、食量均無顯著性差異。
　　8.GTT實驗結(jié)果表明，在正常飲食飼養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的胰島素敏感性無顯著差異;而在高脂飲食飼養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性明顯高于野生型小鼠。
　　9.IT