Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模型的構建及胰島素敏感性研究.pdf

1、人們很早就知道脂肪組織是人體最大的儲能器官，隨著上個世紀九十年代Leptin（瘦素）的發(fā)現，人們逐漸意識到脂肪組織也是一個高度活躍的內分泌器官，它能分泌各種生物活性肽或蛋白質，統稱為脂肪因子，參與調節(jié)機體許多重要的病理生理過程。
　　由于肥胖已成為全球性健康問題，是許多重要疾病的主要危險因子，而體內脂肪組織過多又是肥胖患者的重要特點之一，因此，了解脂肪因子與肥胖的關系，探索脂肪因子的具體生理功能，對治療肥胖產生的病理學后果是非常有

2、價值的。目前，人們對于脂肪因子的研究已取得許多重要進展，比如有學者提出用Leptin或Leptin聯合低劑量胰島素治療糖尿病，有助于維持血糖穩(wěn)態(tài);前期大量研究證明Visfatin可以作為治療腦卒中的新靶點，等等。
　　在過去二十年間，不斷有新的脂肪因子被發(fā)現，目前科學界大概報道了超過100種脂肪因子。本室于2008年首次利用限食模型找到了一個新的脂肪因子，取名為Subfatin。
　　本室前期的初步試驗結果表明:Subfat

3、in在白色脂肪組織表達較高，其在限食大鼠的白色脂肪組織中表達下調，而在高脂飲食誘導的肥胖小鼠白色脂肪組織中表達上調，在脂肪細胞分化過程中表達逐漸升高。據此我們認為，Subfatin可能參與脂肪功能的調節(jié)，并影響肥胖及機體代謝。
　　制備脂肪細胞特異性過表達的轉基因動物模型，是研究脂肪因子整體功能的可靠手段之一。為了研究脂肪細胞來源的Subfatin對脂肪組織生物學及代謝功能的影響，本課題構建了Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模

4、型，并對該小鼠模型的胰島素敏感性進行了探索。
　　實驗方法:
　　1.pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質粒的構建
　　(1)利用pIRES-EGFP-Subfatin質粒PCR擴增獲得Subfatin cDNA-his6，并將其插入pBS aP2 promoter(5.4 kb) polyA質粒，構建了pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質粒，即Subfatin脂

5、肪組織特異性過表達載體。
　　(2)對pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質粒進行基因測序。
　　2.轉基因小鼠的制備
　　(1)將線性化的載體片段（含aP2 promoter、Subfatin cDNA-his6、Poly A）顯微注射進C57BL/6小鼠的受精卵中。
　　(2)將受精卵移植入C57BL/6假孕母鼠的輸卵管壺腹部，監(jiān)護假孕母鼠生產，鑒定F0代轉基因小鼠的基因型。

6、　　(3)選出陽性首建鼠，與C57BL/6小鼠回交，獲得F1代轉基因小鼠，鑒定基因型。
　　3.轉基因小鼠的表達驗證
　　(1)應用半定量RT-PCR、Real-time PCR的方法檢測Subfatin基因的轉錄情況。
　　(2)應用免疫組化的方法檢測脂肪組織Subfatin蛋白的表達情況。
　　(3)用ELISA測定血清中Subfatin蛋白的濃度。
　　4.轉基因小鼠的胰島素敏感性研究
　　(1

7、)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉基因小鼠的體重、食量進行稱重。
　　(2)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉基因小鼠進行葡萄糖耐量實驗(GTT)。
　　(3)在高脂飲食條件下對轉基因小鼠進行胰島素耐量實驗(ITT)。
　　(4)在高脂飲食條件下對轉基因小鼠進行高胰島素性正糖(HIEG)鉗夾實驗。
　　結果:
　　1.基因測序結果表明，pBluescriptⅡ SK(+)-aP2-Subfatin質粒上aP2 P

8、romoter-Subfatin區(qū)域的核苷酸序列分別與小鼠aP2 Promoter基因核苷酸序列及SubfatinmRNA編碼序列一致。說明Subfatin脂肪組織特異性過表達載體構建成功。
　　2.對假孕母鼠產下的F0代轉基因小鼠進行基因型鑒定，得到四只陽性首建鼠。
　　3.半定量RT-PCR結果表明，在所取的腦組織、腎組織、心臟組織、肌肉組織、棕色脂肪組織和白色脂肪組織中，外源性Subfatin(Subfatin-his

9、6)只有在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中是過表達的。
　　4.Real-time PCR結果表明，Subfatin在陽性轉基因小鼠脂肪組織中的轉錄水平大大高于野生型小鼠，說明轉基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達的。
　　5.免疫組化的結果表明，Subfatin蛋白在陽性轉基因小鼠白色脂肪組織中的表達明顯高于野生型小鼠，同樣說明轉基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達的。
　　6.ELISA的結果表明，Subf

10、atin蛋白在陽性轉基因小鼠血清中的濃度的確高于野生型小鼠，該結果與Subfatin蛋白的分泌性質相符合，同時也驗證了其在轉基因小鼠體內是過表達的。
　　7.在正常飲食或高脂飲食飼養(yǎng)條件下，轉基因小鼠和野生型小鼠的體重、食量均無顯著性差異。
　　8.GTT實驗結果表明，在正常飲食飼養(yǎng)條件下，轉基因小鼠和野生型小鼠的胰島素敏感性無顯著差異;而在高脂飲食飼養(yǎng)條件下，轉基因小鼠的胰島素敏感性明顯高于野生型小鼠。
　　9.IT