FAT-CD36缺失對小鼠肝臟胰島素敏感性的影響.pdf

1、目的：人類白細胞分化抗原36（Cluster of Differentiation,CD36）,又名脂肪酸轉運酶（Fatty Acid Translocase,FAT）是連接機體脂肪酸代謝和炎癥發(fā)生的重要膜糖蛋白；同時，它又與機體的葡萄糖代謝過程緊密相連。大量研究證實機體FAT/CD36蛋白的高表達與非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和胰島素抵抗（Insulin Resi

2、stance，IR）等代謝綜合癥（Metabolic Syndrome,MS）的發(fā)生呈正相關關系；同時，有研究發(fā)現FAT/CD36基因缺失也能引起肝臟NAFLD和IR的發(fā)生，但其中具體發(fā)病的分子機制目前仍然不完全清楚。本研究旨在初步探討FAT/CD36基因缺失在加重肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用及機制，為臨床上預防和治療與FAT/CD36蛋白有關的IR和2型糖尿病（Type2 Diabetes Mellitus,T2DM）提供相關的理論基礎

3、。
　　方法：
　　第一部分、選取6-8周齡具有C57BL/6J遺傳背景基因的雄性野生型（WT）小鼠作為體內實驗動物模型，分別予以正常飲食飼料（Normal Chow Diet,NCD）和高脂肪酸飲食飼料（High Fatty Diet，HFD）喂養(yǎng)12周。飼養(yǎng)期間，每周稱取小鼠的體重并記錄；在喂養(yǎng)到第10和第11周分別對兩組小鼠進行葡萄糖耐量試驗（Glucose Tolerance Test,GTT）和胰島素耐量試驗（In

4、sulin Tolerance Test,ITT）的檢測，了解機體對葡萄糖的代謝和對胰島素刺激的敏感性情況。小鼠造模喂養(yǎng)期結束后麻醉解剖，取小鼠血清和肝臟組織分別做以下試驗檢測：血清葡萄糖和胰島素濃度檢測，了解機體對葡萄糖的代謝和胰島素分泌情況；肝臟組織石蠟切片蘇木精-伊紅（H&E）染色和冰凍切片油紅O（Oil Red O,ORO）染色以及新鮮肝臟組織中甘油三脂（TG）含量的定量檢測，了解肝臟細胞脂肪變性的嚴重程度和肝內脂質蓄積的情況；

5、蛋白免疫印跡（Western Bloting）技術檢測肝臟FAT/CD36蛋白表達的水平，了解HFD能否誘導肝臟FAT/CD36蛋白的異常高表達；Western-blot技術檢測肝臟胰島素信號通路相關蛋白（蛋白激酶B, AKT和磷酸化蛋白激酶B,p-AKT）的表達水平，了解肝臟胰島素信號通路的活化水平。
　　第二部分、選取6-8周齡具有C57BL/6J遺傳背景基因的雄性野生型（WT）和FAT/CD36基因敲除（CD36-/-）小鼠

6、作為體內實驗動物模型，分別予以高脂肪酸飼料（HFD）喂養(yǎng)12周。造模飼養(yǎng)期間，每周稱取兩組小鼠的體重并記錄；喂養(yǎng)結束后麻醉解剖，取小鼠血清和肝臟組織分別做以下試驗檢測：稱取每只小鼠肝臟重量并記錄，計算肝臟與體重的比值；血清胰島素水平檢測了解機體胰島素的分泌情況；血清FFA、TG和TC水平檢測，了解機體內脂質的代謝情況；血清TNF-α和IL-6水平檢測，了解機體全身的炎癥水平；肝臟組織石蠟切片的H&E染色和冰凍切片的ORO染色以及新鮮肝臟

7、組織中TG含量的定量檢測，了解肝臟細胞脂肪變性程度和肝臟內脂質蓄積情況；實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術分別檢測炎癥因子（TNF-α；IL-6和IL-1β）和巨噬細胞趨化因子（巨噬細胞趨化蛋白1，MCP-1；巨噬細胞炎性蛋白1，MIP-1和巨噬細胞炎性蛋白2，MIP-2）的基因表達水平以及小鼠肝臟成熟巨噬細胞表面標志物（F4/80）的免疫組織化學染色檢測肝臟巨噬細胞的浸潤情況和肝內炎癥因子水平；Western-blot技術檢測肝臟

8、胰島素信號通路相關蛋白（磷脂酰肌醇3激酶,PI3K；AKT和p-AKT）的表達水平，了解肝臟胰島素信號通路的活化情況。
　　第三部分、選取人類肝癌細胞株HepG2細胞，分別予以人白細胞介素6，（IL-620ng/ml）和人腫瘤壞死因子-α（TNF-α25ng/ml）處理培養(yǎng)，建立體外細胞炎癥模型。實驗過程中HepG2細胞加各處理因素后，被分為對照組、TNF-α處理組、IL-6處理組、對照+胰島素組、TNF-α+胰島素處理組和IL-

9、6+胰島素處理組，處理培養(yǎng)24小時后分別進行以下試驗檢測：HepG2細胞的葡萄糖攝取和消耗試驗，了解HepG2細胞對葡萄糖的代謝和對胰島素敏感性的變化情況；Western-blot技術檢測細胞的胰島素信號通路相關蛋白（胰島素受體底物1，IRS1；AKT和p-AKT）的表達水平，了解HepG2細胞胰島素信號通路的激活情況。
　　結果：
　　第一部分、WT小鼠造模喂養(yǎng)12周后各項實驗檢測結果發(fā)現，HFD喂養(yǎng)的小鼠的體重和肝臟FA

10、T/CD36蛋白的表達水平明顯增加（P＜0.05）；GTT和ITT檢測發(fā)現，HFD喂養(yǎng)的小鼠出現明顯的葡萄糖和胰島素耐量不良；各項血清生化指標檢測發(fā)現，HFD喂養(yǎng)的小鼠血清葡萄糖和胰島素的水平明顯升高（P＜0.05）；肝臟組織切片HE和ORO染色以及新鮮肝臟組織TG含量的定量檢測發(fā)現，HFD喂養(yǎng)的小鼠肝臟細胞出現大量的空泡樣脂肪變性，肝臟內脂質蓄積和TG的含量明顯增加；肝臟組織蛋白Western-blot檢測發(fā)現，HFD喂養(yǎng)的小鼠肝臟胰

11、島素信號通路（P-AKT/AKT）相關蛋白的表達水平明顯減少。
　　第二部分、WT和CD36-/-兩組小鼠造模喂養(yǎng)12周期間，對小鼠體重統計分析后發(fā)現，在喂養(yǎng)的第6周后CD36-/-小鼠的體重較WT小鼠明顯減輕，但前者的肝臟體重比卻明顯增加，肝臟飽滿顏色發(fā)白，出現明顯的脂肪肝形態(tài)；血清生化各項檢測指標發(fā)現，CD36-/-小鼠的血清胰島素、TG、FFA、TC和IL-6的水平較WT小鼠明顯增加（P＜0.05）；肝臟組織切片H&E和OR

12、O染色以及新鮮肝組織TG含量的定量檢測發(fā)現，FAT/CD36基因缺失小鼠的肝臟細胞出現明顯的空泡樣脂肪變性，肝內脂質蓄積和TG的含量明顯增加；RT-PCR和F4/80免疫組化染色檢測發(fā)現，FAT/CD36基因缺失小鼠的肝臟巨噬細胞趨化因子，炎性蛋白和炎癥因子的基因轉錄表達水平明顯增加（P＜0.05），肝臟F4/80黃染程度明顯加重；肝臟蛋白Western Blottting檢測發(fā)現，FAT/CD36基因缺失小鼠胰島素信號通路（PI3K/

13、AKT）相關蛋白的表達水平明顯減少。
　　第三部分、HepG2細胞葡萄糖攝取和消耗試驗檢測發(fā)現，炎癥因子（TNF-α、IL-6）處理組的細胞較對照組對葡萄糖的攝取和消耗明顯減少，同時細胞加胰島素處理后，炎癥因子處理組的細胞對胰島素刺激的敏感性明顯降低，葡萄糖的攝取和消耗較對照組細胞進一步減少（P＜0.05）；細胞蛋白Western-blot檢測發(fā)現，炎癥因子處理組的細胞較對照組胰島素信號通路（IRS1/PI3K/AKT）相關蛋白的