尼古丁對(duì)血管功能和胰島素敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 本課題組前期建立的尼古丁長(zhǎng)期治療大鼠模型上，我們首次發(fā)現(xiàn)尼古丁治療組大鼠的主動(dòng)脈對(duì)硝普鈉的內(nèi)皮非依賴的舒張功能特異性的增強(qiáng)了。此外，該模型的胰島素抵抗指數(shù)顯著降低。這提示，尼古丁不僅可使血管中膜平滑肌一氧化氮信號(hào)通路增敏，還增強(qiáng)胰島素敏感性。
　　 尼古丁主要經(jīng)由尼古丁受體發(fā)揮作用。尼古丁受體屬配體門(mén)控離子通道型受體，由5個(gè)亞基組成五聚體，亞基的種類有17種，配體結(jié)合位點(diǎn)在α亞基上。傳統(tǒng)意義上，尼古丁受體

2、分為肌肉型和神經(jīng)型，前者介導(dǎo)神經(jīng)肌肉接頭傳遞，后者介導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞。最近研究顯示，神經(jīng)型尼古丁受體也可在許多非神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，而且，非神經(jīng)細(xì)胞上尼古丁受體及其功能的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)吸引不同領(lǐng)域科學(xué)家對(duì)這一經(jīng)典受體產(chǎn)生新的研究興趣。例如，免疫細(xì)胞上α7尼古丁受體的闡明，觸發(fā)人們研究尼古丁受體激動(dòng)劑對(duì)感染和炎癥性疾病的治療學(xué)意義。平滑肌細(xì)胞上，慢性尼古丁暴露可通過(guò)上調(diào)α7受體來(lái)增強(qiáng)胰島素刺激的絲裂原信號(hào)通路。當(dāng)前，在非神經(jīng)組織上考察尼

3、古丁受體及其功能活性，將揭示尼古丁受體的新功能。而確定特定的尼古丁功能受體，對(duì)于發(fā)揮尼古丁有益的治療作用意義重大。
　　 綜上所述，本課題擬深入研究尼古丁長(zhǎng)期治療對(duì)血管功能和胰島素敏感性的影響和機(jī)制，這不僅有利于明確尼古丁對(duì)心血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用，揭示尼古丁受體的新功能和血管舒張新通路，也對(duì)尋找治療血管疾病和胰島素抵抗的新靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 [方法]
　　 第一部分：尼古丁對(duì)血管功能的影響及機(jī)制研究。該部

4、分研究首先在本課題組前期建立的大鼠尼古丁長(zhǎng)期治療模型上考察主動(dòng)脈外膜、內(nèi)膜抗收縮功能；內(nèi)膜依賴的血管舒張功能；中膜收縮和內(nèi)膜非依賴的舒張功能。接著，進(jìn)一步考察尼古丁增強(qiáng)中膜一氧化氮舒張反應(yīng)機(jī)制。一方面在大、小鼠尼古丁治療模型上考察尼古丁對(duì)中膜舒張反應(yīng)影響的時(shí)間過(guò)程以明確該作用是急性作用還是慢性作用，另外還觀察了尼古丁治療后對(duì)胰島素引起的中膜舒張反應(yīng)的影響以初步判斷尼古丁致舒張反應(yīng)增強(qiáng)作用是否具有普遍意義。然后在離體血管實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用抑制劑和

5、擬似物，檢測(cè)關(guān)鍵蛋白表達(dá)和活性的方法明確該作用是否經(jīng)由一氧化氮信號(hào)通路的3’，5’-環(huán)鳥(niǎo)苷-磷酸依賴的信號(hào)通路。隨后，通過(guò)制備基因芯片分析預(yù)測(cè)和經(jīng)典通路上逐步排查的方法，尋找尼古丁改變的一氧化氮通路下游可能的靶點(diǎn)，如環(huán)氧合酶一2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵、AMPK、Rho等，再通過(guò)Western-blot，以及血管功能實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終確認(rèn)靶點(diǎn)。另一方面制備尼古丁受體阻斷劑和尼古丁同時(shí)治療的動(dòng)物模型并使用α7尼古丁受體敲除小鼠進(jìn)行尼古丁長(zhǎng)期治療

6、，再進(jìn)行血管功能實(shí)驗(yàn)從而尋找介導(dǎo)該作用的尼古丁受體。最后運(yùn)用清醒測(cè)壓技術(shù)，檢測(cè)尼古丁模型組與生理鹽水組血壓等指標(biāo)的差別。
　　 第二部分：尼古丁對(duì)胰島素敏感性的影響及機(jī)制研究。首先在尼古丁長(zhǎng)期治療的正常大鼠模型上通過(guò)血清學(xué)胰島素抵抗指數(shù)、整體胰島素耐量實(shí)驗(yàn)和糖耐量實(shí)驗(yàn)等多個(gè)指標(biāo)驗(yàn)證尼古丁對(duì)胰島素增敏的作用。接著針對(duì)機(jī)制研究，一方面在整體水平進(jìn)行尼古丁給藥模型的各部位脂肪稱重，另一方面，在第一部分制備的尼古丁給藥組和生理鹽水組的主

7、動(dòng)脈基因芯片上尋找胰島素敏感性相關(guān)基因的改變。同時(shí)，檢測(cè)尼古丁治療大鼠模型的四種胰島素敏感組織的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平，從而尋找尼古丁影響的靶蛋白。另一方面，制備外周尼古丁受體阻斷劑和尼古丁同時(shí)治療的動(dòng)物模型，以確認(rèn)尼古丁致胰島素增敏的中樞或外周受體機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分：尼古丁對(duì)血管功能的影響及機(jī)制研究
　　 1.尼古丁長(zhǎng)期治療不影響主動(dòng)脈外膜和內(nèi)膜的抗收縮功能；不影響內(nèi)膜依賴的舒張功能；不影響中膜平

8、滑肌對(duì)新福林的收縮作用，而特異性的增強(qiáng)硝普鈉引起的內(nèi)皮非依賴性的中膜舒張反應(yīng)。
　　 2.尼古丁治療后Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6J小鼠中膜收縮反應(yīng)不改變，但硝普鈉引起的內(nèi)皮非依賴性的中膜舒張反應(yīng)都顯著增強(qiáng)。大鼠治療3周出現(xiàn)該現(xiàn)象，6周穩(wěn)定出現(xiàn)該現(xiàn)象。小鼠治療4周出現(xiàn)該現(xiàn)象，6周穩(wěn)定出現(xiàn)該現(xiàn)象。尼古丁治療后SD大鼠中膜對(duì)胰島素引起的舒張反應(yīng)也顯示增強(qiáng)。這說(shuō)明該增強(qiáng)作用是長(zhǎng)期慢性的作用結(jié)果而非急性作用。

9、　　 3.硝普鈉引起的生理鹽水和尼古丁組的舒張反應(yīng)可被可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ完全阻斷，可被cGMP模擬物模擬，可被cGMP依賴的蛋白激酶抑制劑阻斷，而PKG蛋白表達(dá)在兩組間不改變，蛋白活性沒(méi)有明顯差異。這提示該舒張?jiān)雒魴C(jī)制是經(jīng)由PKG信號(hào)通路，且發(fā)生在PKG的下游靶位。
　　 4.主動(dòng)脈芯片結(jié)果顯示與一氧化氮通路舒張相關(guān)基因中尼古丁治療組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵基因sarcoplasmic reticulum calcium-ATP

10、ase3較生理鹽水組上調(diào)1.56倍，熱休克蛋白27較生理鹽水組下調(diào)0.51倍。另外與一氧化氮通路尚無(wú)報(bào)道關(guān)聯(lián)的COX-2基因表達(dá)顯著下調(diào)0.09倍，我們也將它作為可能影響舒張通路的備選基因。
　　 5.根據(jù)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證：COX-2蛋白表達(dá)在尼古丁組主動(dòng)脈平滑肌顯著下調(diào)而COX-2非選擇性抑制劑Indomethacin和選擇性抑制劑Meloxicam都不能取消尼古丁組和生理鹽水組間血管舒張反應(yīng)的差別；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑Thaps

11、igargin不能取消尼古丁組和生理鹽水組間血管舒張反應(yīng)的差別；尼古丁組主動(dòng)脈與收縮相關(guān)蛋白Hsp27表達(dá)不變。這些結(jié)果排除了SERCA3、Hsp27和COX-2參與舒張?jiān)雒舻臋C(jī)制。
　　 6.進(jìn)一步使用Rho激酶抑制劑Y-27632不能取消尼古丁組和生理鹽水組間血管舒張反應(yīng)的差別，這排除了尼古丁經(jīng)由抑制Rho通路從而使鈣收縮脫敏以增強(qiáng)舒張的可能。
　　 7.運(yùn)用AMPK抑制劑Compond C不能取消尼古丁組和生理鹽水

12、組間血管舒張反應(yīng)的差別，又排除了最新提出的AMPKα1舒張通路的參與。
　　 8.使用非選擇性阻斷劑20 mM的Tetraethylammonium阻斷鈣激活鉀通道和電壓依賴性鉀通道可完全取消尼古丁組和生理鹽水組的舒張反應(yīng)差別，而選擇性阻斷ATP敏感鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道都不能取消兩組間血管舒張反應(yīng)的差別。進(jìn)一步選擇性阻斷大電導(dǎo)鈣激活鉀通道以及阻斷4-AP敏感的電壓依賴性鉀通道卻都不能取消尼古丁組和生理鹽水組的舒張反應(yīng)差別。而等

13、滲高鉀液可取消硝普鈉引起的尼古丁組和生理鹽水組的舒張反應(yīng)差別。這說(shuō)明尼古丁致硝普鈉舒張?jiān)雒舻臋C(jī)制是經(jīng)由TEA敏感的鉀通道，而不是的BKCa、KATP、Kir和4-AP敏感的電壓依賴性鉀通道。
　　 9.外周神經(jīng)型尼古丁受體阻斷劑Hexamethonium和尼古丁同時(shí)治療可以取消尼古丁組和生理鹽水組間硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)差別。而尼古丁治療的α7尼古丁受體敲除小鼠，硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象仍然存在，說(shuō)明尼古丁使舒張?jiān)雒舻?/p>

14、機(jī)制是經(jīng)由外周非α7尼古丁受體產(chǎn)生。
　　 10.尼古丁長(zhǎng)期給藥后不影響基礎(chǔ)狀態(tài)的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓但延長(zhǎng)心動(dòng)間期；不影響硝普鈉急性給藥引起的血壓下降。
　　 第二部分：尼古丁對(duì)胰島素敏感性的影響及機(jī)制研究
　　 1.尼古丁長(zhǎng)期治療后不影響血清血糖水平，但顯著減少胰島素和甘油三酯水平，顯著減少HOMA法的胰島素抵抗指數(shù)，說(shuō)明基礎(chǔ)狀態(tài)下的胰島素增敏。
　　 2.尼古丁治療3周和6周后胰島素耐量實(shí)驗(yàn)和

15、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)都顯示尼古丁組血糖降低的速度和幅度較生理鹽水組和生理鹽水限食組都更為顯著，說(shuō)明刺激狀態(tài)下的胰島素增敏。
　　 3.尼古丁長(zhǎng)期治療后皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪都明顯減少，且內(nèi)臟脂肪減少更為顯著。
　　 4.主動(dòng)脈基因芯片顯示尼古丁給藥后脂代謝相關(guān)基因如脂酶、腎上腺素受體β3顯著上調(diào)；能量消耗相關(guān)基因解耦聯(lián)蛋白1顯著上調(diào)；胰島素敏感性相關(guān)基因過(guò)氧化物酶增殖體受體顯著上調(diào)。
　　 5.尼古丁治療不影響PPARγ蛋

16、白在骨骼肌、肝臟、內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的表達(dá)。尼古丁治療顯著減少骨骼肌COX-2表達(dá)，而不改變肝臟、內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的表達(dá)。尼古丁治療顯著增加內(nèi)臟脂肪和下丘腦AMPK表達(dá)，而不改變骨骼肌、肝臟和皮下脂肪的表達(dá)。
　　 6.外周尼古丁受體阻斷劑合并尼古丁治療并不阻斷尼古丁增強(qiáng)胰島素敏感性的作用，但阻斷尼古丁減少血清甘油三酯，說(shuō)明尼古丁致胰島素增敏主要經(jīng)由中樞機(jī)制。
　　 [結(jié)論]
　　 本課題主要發(fā)現(xiàn)并探討了尼古丁

17、兩個(gè)全新的作用和機(jī)制：
　　 一、尼古丁長(zhǎng)期治療可特異性增強(qiáng)主動(dòng)脈中膜對(duì)一氧化氮的舒張反應(yīng)。該增敏作用是尼古丁經(jīng)由非α7的外周神經(jīng)型尼古丁受體影響了PKG下游途徑產(chǎn)生。SERCA3、Hsp27和COX-2不參與該下游增敏途徑；Rho和AMPK也不參與該下游增敏途徑。該增敏途徑是通過(guò)增強(qiáng)PKG下游的TEA敏感鉀通道開(kāi)放，引起細(xì)胞膜超極化從而抑制外鈣內(nèi)流，導(dǎo)致舒張反應(yīng)增強(qiáng)，并且該鉀通道不是平滑肌上目前已知的可被PKG直接激活的BKc