胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-Hes1的構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證研究.pdf

1、器官移植是治療人類器官衰竭，挽救人類生命的有效方法。但器官移植供體嚴(yán)重短缺，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患者的需要。隨著科學(xué)研究的深入和科學(xué)技術(shù)的提高，異種器官移植逐漸成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。小型豬的血液生理生化指標(biāo)與人類接近，器官大小也接近于人，生長(zhǎng)周期又短，因此小型豬可以作為制備特殊器官的生物反應(yīng)器，成為異種器官移植供體來源的最佳提供者。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)研究的發(fā)展，利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行人豬嵌合，在豬體內(nèi)長(zhǎng)出人的器官成為器

2、官移植供體可靠來源之一。
　　糖尿病和胰腺癌都有造成胰腺器官衰竭的可能，隨時(shí)都有生命危險(xiǎn)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)能力的提高和醫(yī)院移植技術(shù)的不斷完善，糖尿病和胰腺癌患者對(duì)胰腺移植的需求與日俱增，但胰腺移植也面臨同樣的問題，供體嚴(yán)重缺乏，配型困難。利用人豬嵌合技術(shù)，在胰腺缺陷的豬胚胎中注入患者的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，讓豬體內(nèi)長(zhǎng)出病人的胰腺，不僅解決了糖尿病和胰腺癌患者胰腺移植供體不足的問題，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了個(gè)性化器官移植，減少免疫排斥。要實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)生產(chǎn)胰

3、腺的偉大工程，首先我們要制備出胰腺缺陷的豬胚胎。
　　PDX1在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演重要角色，特異地表達(dá)于胰腺中;Notch信號(hào)通路對(duì)早期胰腺發(fā)育及胰腺細(xì)胞命運(yùn)決定起到重要的調(diào)節(jié)作用，Hes1是Notch信號(hào)通路下游重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子，其基因編碼的蛋白主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄抑制，通過轉(zhuǎn)錄抑制影響胚胎發(fā)育期的細(xì)胞增殖和分化。本研究以eGFP為報(bào)告基因，Hes1為目的基因，構(gòu)建了胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP和PDX1-Hes1。通

4、過體外轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞試驗(yàn)來驗(yàn)證載體在體外的特異性表達(dá)，通過制備轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)來驗(yàn)證載體在體內(nèi)的特異性表達(dá)情況以及對(duì)胰腺缺陷動(dòng)物模型的制備進(jìn)行相關(guān)探索，本研究為制備胰腺缺陷豬胚胎奠定基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一:胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP和PDX1-Hes1的構(gòu)建及體外驗(yàn)證。成功構(gòu)建了PDX1-eGFP和PDX1-Hes1這兩個(gè)載體。PDX1-eGFP轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞和成纖維細(xì)胞48 h后，熒光顯微觀察結(jié)果

5、為在小鼠胰島β細(xì)胞中發(fā)光，而在非胰腺細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中不發(fā)光，說明PDX1-eGFP的表達(dá)具有胰腺特異性轉(zhuǎn)染48 h，提取細(xì)胞蛋白，開始用Western Blot檢測(cè)。得到的結(jié)果是，小鼠胰島β細(xì)胞蛋白有eGFP表達(dá)，成纖維細(xì)胞蛋白無eGFP表達(dá)，同樣說明PDX1-eGFP的表達(dá)具有胰腺特異性。PDX1-Hes1和空載體分別轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞48 h后，提取RNA和蛋白，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blot分析，結(jié)果均顯示，

6、Hes1在轉(zhuǎn)PDX1-Hes1的小鼠胰島β細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)空載體的小鼠胰島β細(xì)胞，這說明PDX1-Hes1可以使Hes1基因在胰腺細(xì)胞中特異性過表達(dá)。
　　試驗(yàn)二:PDX1-eGFP和PDX1-Hes1在小鼠體內(nèi)的表達(dá)研究。通過轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，成功獲得了1只PDX1-eGFP小鼠和2只PDX1-Hes1小鼠。PDX1-eGFP小鼠通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blot分析，結(jié)果均表明，eGFP在PDX1-eGFP

7、小鼠的胰腺中表達(dá)，而在PDX1-eGFP小鼠的肝中與對(duì)照小鼠的胰腺和肝臟中均不表達(dá);更有說服力的一個(gè)結(jié)果是，通過活體熒光觀察，PDX1-eGFP小鼠僅胰腺部位有明顯綠色熒光，而PDX1-eGFP小鼠的其他部位和對(duì)照小鼠的全身均無綠色熒光。這說明eGFP在PDX1啟動(dòng)子的啟動(dòng)下在小鼠體內(nèi)的胰腺中特異性表達(dá)。PDX1-Hes1小鼠通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示，Hes1在PDX1-Hes1小鼠胰腺中的表達(dá)明顯高于對(duì)