睪丸組織高表達(dá)基因fancd2os的細(xì)胞特異性分析及初步功能研究.pdf

1、研究目的：
　　在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）和蛋白印跡技術(shù)（Western blotting）從mRNA和蛋白水平分析fancd2os基因在睪丸組織不同細(xì)胞系中的表達(dá)譜；通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色分析 FANCD2OS蛋白在睪丸組織中的細(xì)胞定位；并進(jìn)一步建立過表達(dá)fancd2os基因的HEK293T細(xì)胞模型，從細(xì)胞水平深入探討fancd2os基因的潛在功能。
　　研究方法：<

2、br>　　1.通過實(shí)時(shí)定量PCR分析fancd2os mRNA在精原細(xì)胞（GC1-spg）、精母細(xì)胞（GC2-spd）、睪丸 Leydig間質(zhì)細(xì)胞（TM3）、睪丸 Sertoli支持細(xì)胞（TM4）四種細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　2.運(yùn)用Western blotting方法檢測(cè)FANCD2OS蛋白在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細(xì)胞系的表達(dá)；
　　3.利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色分析FANCD2OS蛋白在睪丸組

3、織中的細(xì)胞定位；
　　4.建立fancd2os基因過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞模型，分別利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及Western blotting檢測(cè)fancd2os基因的過表達(dá)情況；
　　5.采用CCK8方法檢測(cè)過表達(dá)fancd2os基因?qū)EK293T細(xì)胞增殖能力的影響；
　　6.利用Western blotting檢測(cè)過表達(dá)fancd2os基因后HEK293T細(xì)胞Caspase3蛋白的水平；
　

4、　7.運(yùn)用 Caspase3熒光染色試劑盒對(duì)紫外誘導(dǎo)后 HEK293T細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行分析；
　　8.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)fancd2os基因?qū)ψ贤庹T導(dǎo)HEK293T細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位水平的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示fancd2os mRNA在四種細(xì)胞系中均有表達(dá)，但是在TM3中的表達(dá)水平相對(duì)較高；
　　2. Western blotting結(jié)果顯示FANCD2OS蛋白在四種細(xì)

5、胞中都有表達(dá)，在TM3中的表達(dá)水平相對(duì)較高；
　　3.免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色均發(fā)現(xiàn)FANCD2OS蛋白主要定位在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中；
　　4. RT-PCR和Western blotting分析顯示在HEK293T細(xì)胞模型中檢測(cè)到fancd2os基因的過表達(dá)；
　　5. CCK8結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞增殖能力明顯高于空載體組和裸細(xì)胞組（p<0.05）;
　　6. Western blotting

6、結(jié)果顯示過表達(dá)組活化型Caspase3含量明顯高于其余兩組；
　　7.熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的Caspase3熒光陽性信號(hào)明顯多于空載體組和對(duì)照組；
　　8.流式細(xì)胞術(shù)分析表明過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡程度明顯高于空載體組和裸細(xì)胞組（p<0.01），線粒體膜電位下降的百分比明顯高于空載體組和裸細(xì)胞組（p<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1. fancd2os基因在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細(xì)胞系