sirna特異性抑制h.pyloriflaa、caga基因表達

1、中山大學博士學位論文siRNA特異性抑制H.pylori flaA、cagA基因表達姓名：嚴燕國申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導教師：詹文華20060401◇中山大學博士論文 s i R N A 特異性抑制H ．p y l o r if l a A 、c a g A 基因表達鞭毛蛋白，決定著H p 鞭毛的功能。c a g A 基因是H p 的重要毒力基因，以它作為H p的毒力標志，可將H p 分炭J c a g A + 菌株和c a

2、g A ’菌株兩大類，研究顯示c a g A + 菌株感染者胃粘膜炎癥、損傷程度較c a g A ‘菌株重，提示c a g A 基因可能與H p 感染相關炎癥發(fā)生有關，具體機制尚不明確；c a g A + 菌株感染者胃癌發(fā)生的危險較c a g A ‘菌株高數(shù)倍，表明c a g A 基因與H p 感染相關胃癌關系密切，因此深入地了解c a g A 的功能具有十分重要的意義。由于H p 是革蘭氏陰性桿菌，生長較緩慢，對外界環(huán)境敏感，培養(yǎng)易遭

3、污染，不易人工轉(zhuǎn)化，國內(nèi)外有關其轉(zhuǎn)化的方法及報道不多，電轉(zhuǎn)化的報道更少，本實驗擬以I 塒A i 為工具研究H p 基因并試圖干擾其基因表達，因而對其轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化是十分必要的?！緦嶒灧譃橐韵氯糠郑旱谝徊糠謘 i R N A 抑制l i p f l a A 基因表達目的優(yōu)化H p 的電轉(zhuǎn)化條件；利用s i R N A 特異性抑制f l a A 基因表達。方法設計熒光標記的非特異性s i R N A ，組合不同的電場強度和脈沖時間、細

4、菌濃度與s i R N A 濃度；找到電轉(zhuǎn)化H p 的最佳條件，觀察轉(zhuǎn)化效率和H p 存活率；然后設計針對基因序列已明確的f l a A 基因( N O ．A Y 3 1 9 2 9 8 ) 的特異性s i R N A 分子S I - S 5 及非特異性s i R N A 分子一S 6 ，在最佳電轉(zhuǎn)化條件下將s i R N A 轉(zhuǎn)化H p ，R T - P C R 方法檢測f l a A m R N A 的抑制率。實驗分組：f l a

5、A —S l ，f l a A —S 2 ，f l a A —S 3 ，f l a A —S 4 ，f l a A —S 5 ，對照組：f l a A ．S 6 。結(jié)果電場強度和脈沖時間是影響轉(zhuǎn)化效率的兩個關鍵因素，最佳轉(zhuǎn)化條件為2 5 k V ／c m 電場強度下脈沖6 m s ，當細菌濃度為1 0 8 C F U ／m l ，s i R N A 為1 0 0 9 9 ／m l 時電轉(zhuǎn)化率最高達9 5 ％，高于其它組( PO ．0 5

6、 ) 。f l a A —s 2 、f l a A —s 3組在轉(zhuǎn)化后f l a Am R N A 抑制率隨s i R N A 濃度增大而增加，在1 0 0 9 9 ／m 1 分別為7 2 ．1 ％和5 3 ．8 ％高于1 0 9 9 ／m l 、1 ．0 9 9 ／m l 組( P < 0 ．0 5 ) 。結(jié)論適當?shù)膱鰪姾兔}沖時間的組合可使轉(zhuǎn)化率達到最大值。特異性s i R N A 可以抑制H p f l a A 表達。第二部分