RNA干擾技術(shù)特異性抑制腎癌survivin表達的體外實驗研究.pdf

1、重慶醫(yī)科大學碩士學位論文RNA干擾技術(shù)特異性抑制腎癌survivin表達的體外實驗研究姓名：徐斌申請學位級別：碩士專業(yè)：外科學指導教師：胡自力20080501重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文S u r v i v i nm R N A 的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以S u r v i v i n 為靶基因的R N A i 治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。目的：第一部分：檢測人。腎癌7 8 6 一O 細胞株中的S u

2、 r v i v i n 基因表達水平，探討S u r v i v i n 基因在人腎癌7 8 6 一O 細胞株中表達的意義。第二部分：設(shè)計針對s u r v i v i n 基因的s i R N A 并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)S u r v i v i n 基因高表達于腎癌以及s h R N A ．S u r v i v i n 抑制7 8 6 一O 細胞內(nèi)S u r v i v i

3、n 基因表達的特點，將s h R N A —S u r v i v i n 及對照質(zhì)粒p G e n e s i l —l轉(zhuǎn)染至7 8 6 一O 后，了解R N A 干擾S u r v i v i n 基因后對7 8 6 一O 活性的影響，并檢測轉(zhuǎn)染后7 8 6 一O 細胞中的S u r v i v i nm R N A 及蛋白表達水平。方法：第一部分：1 ．培養(yǎng)人腎癌7 8 6 ．O 細胞株并用M T T 法繪制生長曲線；2 ．R T

4、 - P C R 檢測S u r v i v i nm R N A 在7 8 6 一O 細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3 ．W e s t e r n ．b l o t 檢測S u r v i v i n 基因蛋白質(zhì)的表達水平。第二部分：1 ．根據(jù)s u r v i v i n 基因在G e n e B a n k 中序列設(shè)計相應(yīng)的三組陽性s i R N A 和一組陰性對照，其轉(zhuǎn)錄模板與p G e n e s i l —l 連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌D

5、H 5 c t 菌株；2 ．挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3 ．提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1 ．重組質(zhì)粒p G e n e s i l ·l —s u r v i v i n I 、p G e n e s i l 一1 一s u r v i v i n 2 、p G e n e s i l ．3 、陰性對照質(zhì)粒眥以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至7 8 6 ．o ；2 ．觀察轉(zhuǎn)染后各組細胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用M T T 法繪制轉(zhuǎn)染后各