HIF-1a特異性小干擾RNA對(duì)HIF-1a及VEGF表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、背景：視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生與缺氧有關(guān)，缺氧狀態(tài)下低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1a)作為一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)等促血管生成因子的表達(dá)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。 目的：從體外研究入手，研究正常氧及低氧環(huán)境下，由真核表達(dá)載體pSUPER<'HI-siHIF-Iα>表達(dá)的HIF-1α特異性小干擾RNA對(duì)HIF-1α表達(dá)的抑制效果及由此引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)差異，為后續(xù)的活體研究

2、提供體外理論依據(jù)。 方法：將pSUPER<'HI-siHIF-Iα>真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE2，運(yùn)用嘌呤霉素篩選建立pSUPERH<'HISiHIF-Iα>真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。采用半定量RT-PCR的方法篩選HIF-1αmRNA抑制效率最高的pSUPER<'HI-siHIF-Iα>穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。然后將該細(xì)胞系、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞于正常氧(20％O<,2>)及低氧環(huán)境(1％O<,2>)下培養(yǎng)，采用

3、半定量RT-PCR及免疫印跡(Western blot)技術(shù)觀察正常氧及低氧環(huán)境下HIF-1a的抑制效果。并采用半定量RT-PCR及ELISA技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)VEGF的表達(dá)差異。 結(jié)果：1)建立的pSUPER<'HI-siHIF-1α>真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中，源于六號(hào)單克隆細(xì)胞的細(xì)胞系(clone-6)中HIF-IαmRNA的抑制效果最明顯。 2)半定量RT-PCR及Western blot結(jié)果表明低氧培養(yǎng)環(huán)境下，相對(duì)

4、于空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，clone-6中HIF-1α的 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平受到明顯抑制。正常氧培養(yǎng)環(huán)境下，clone-6中HIF-1α的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)，但是蛋白質(zhì)表達(dá)水平較低。 3)低氧環(huán)境培養(yǎng)下，clone-6中VEGF mRNA及分泌型蛋白水平較空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組有明顯下調(diào)。而正常氧環(huán)境培養(yǎng)下，clone-6中VEGFmRNA及分泌型蛋白水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。 結(jié)論：在低氧