HIF-1α小干擾RNA抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá).pdf

1、背景和目的： 血管瘤出現(xiàn)前局部皮膚發(fā)白、易伴發(fā)潰瘍等臨床特征提示低氧可能在血管瘤增生中發(fā)揮重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α)作為細(xì)胞對低氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)血管新生作用，已成為重要靶點(diǎn)應(yīng)用于腫瘤治療I期臨床。在血管瘤中，HIF-1α可能是其增生的重要調(diào)控因子，本研究擬探討HIF-1α在血管瘤增生中的調(diào)控機(jī)制。 方法： 1)分離、

2、純化并鑒定原代培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，檢測凍存對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響。2)免疫組化、reat-time PCR和免疫熒光檢測血管瘤組織和血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α及其下游基因的表達(dá)。3)氯化鈷模擬低氧建立HIF-1α高表達(dá)細(xì)胞模型。4)構(gòu)建HIF-1α特異性RNA干擾慢病毒載體，轉(zhuǎn)染血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測HIF-1α mRNA水平，Western Blot檢測HIF-1α蛋白表達(dá)水平。5)沉默HIF-1α，后，RT-

3、PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)mRNA水平，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF蛋白水平。 結(jié)果： 1)膠原酶I消化、CD31免疫磁珠純化所得細(xì)胞經(jīng)體外鑒定，為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，純度達(dá)97％。凍存技術(shù)可成功應(yīng)用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞保存。2)血管瘤組織中HIF-1α及下游基因蛋白表達(dá)升高，mRNA水平較正常組織明顯升高(P<0.

4、05)。血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞常氧下HIF-1α表達(dá)微弱，低氧誘導(dǎo)后表達(dá)升高。3)含100umol/L氯化鈷的培養(yǎng)液培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，可穩(wěn)定誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)。4)構(gòu)建HIF-1α特異性RNA干擾慢病毒滴度達(dá)4.08×108 Tu/ml。轉(zhuǎn)染血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，HIF-1α蛋白水平較空載慢病毒組明顯降低；HIF-1αmRNA水平(HIF-1α/β-actin=0.0850±0.0264)較空載慢病毒組(HIF-1α/β-actin=0

5、.4527±0.0541)明顯降低(P<0.01)。5)沉默HIF-1α后，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA水平(VEGF/β-actin=0.1008±0.0153)較空載慢病毒組(VEGF/β-actin=0.4916±0.1110)明顯降低(P<0.01)；VEGF蛋白水平(201.00±48.82 pg/ml)較空載慢病毒組(1163.01±265.21pg/ml)明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論： 血管瘤組織H