特異性抑制survivin基因表達對胃癌放、化療的增敏作用.pdf

1、【引言】在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，細胞增殖與凋亡失衡是其一個重要機制，凋亡受阻也是導致對腫瘤細胞的各種治療療效耐受的重要原因之一。凋亡過程涉及多條反應途徑和多個調節(jié)因子，機制非常復雜，而凋亡蛋白抑制因子（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族就是其中非常重要的一類抗凋亡因子，其結構的共同點是在它的N端含有一個或者是多個桿狀病毒IAP重復序列（baculovirusIAPrepeat，BIR）串聯(lián)在一起，而C

2、端含或不含有一個環(huán)指（RINGfinger）結構。Survivin是IAP家族中的一個重要成員，多年來的研究表明，其在人類多種惡性腫瘤中均存在高表達，具有強大的抗細胞凋亡功能，與包括胃癌、卵巢癌等等在內(nèi)的多種人類腫瘤的形成、發(fā)展及預后密切相關，其異常的表達水平升高極有可能是導致多種人類惡性腫瘤對化療耐藥和放療抵抗的重要原因。
　　RNAi（RNAinterference）是由導入的雙鏈RNA（doublestrandRNA，dsR

3、NA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，最早由法爾和梅洛于1998年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于地球上的高等植物和動物中。RNAi的機制是將dsRNA導入細胞內(nèi)，dsRNA隨后被Dicer酶(一種RNA酶)Ⅲ剪切，形成具有雙鏈的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），siRNA可與RNA誘導的基因沉默復合物相互結合，從而降解靶向mRNA（與siRNA的堿基序列呈互補關系），特異性的抑制靶基因表達。RNAi技術具有

4、簡便易行、特異高效的特點，被《Science》雜志評為2001年的十大科學進展之一，并名列2002年十大科學進展之首，已被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療領域
　　胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國，發(fā)病率居各類常見良惡性腫瘤的首位。盡管我國對胃癌的預防和治療已取得很大成果，但近年來隨著社會生活水平的提高、工作節(jié)奏的增加等等原因，胃癌的發(fā)病率呈有增高趨勢。在胃的惡性腫瘤中，腺癌占95％。因為胃癌易發(fā)生直接播散、血液轉移和

5、淋巴結轉移，所以中晚期胃癌往往不能手術根治；而胃癌（尤其是腺癌）對放療的敏感性較差，對化療又容易產(chǎn)生耐藥，故治療難度往往大，預后也不是很理想。因此，尋找科學和可行的多種治療途徑增強放療和化療的療效，從而改善預后，業(yè)已成為普通外科領域的熱點研究問題。
　　【目的】觀察survivin基因表達下調對胃癌放、化療敏感性的影響，探討survivin基因RNA干擾對胃癌放、化療增敏的效果和可能的機制，為以survivin為靶基因治療胃癌提供

6、實驗基礎和理論依據(jù)。
　　【方法】本研究分為五個部分：
　　1、構建survivin基因RNA干擾載體，檢測其對胃癌SGC7901細胞survivin基因表達的干擾效果。
　　根據(jù)RNAi設計原則，以及查得的survivin基因的編碼序列，設計、合成2對survivin特異性siRNA引物（S1-1，2；S2-1，2）及1對對照引物（NC-1，NC-2），退火連接，將其分別克隆入真核表達載體pEGFP-C1，經(jīng)測序鑒定

7、無誤，利用脂質體轉染細胞系SGC7901（胃癌），通過G418篩選陽性克隆，利用半定量RT-PCR、Westernblot等技術從mRNA及蛋白表達水平檢測survivin基因抑情況，篩選干涉效果最好的survivinsiRNA載體以及穩(wěn)轉細胞系進行實驗研究。
　　2、特異性抑制survivin基因表達可提高SGC7901細胞對放、化療的敏感性。
　　用MTT法繪制細胞生長曲線，平板克隆形成實驗和多靶單擊模型擬合細胞存活曲線

8、以觀察SGC7901細胞在不同照射劑量下對X線放射治療敏感性的變化；MTT比色法檢測2GyX線照射24h、48h和72h后細胞的生長抑制情況。順鉑、5-FU作用48小時后，用MTT比色法檢測50％抑制濃度（IC50）。5ug/ml順鉑、10ug/ml5-FU作用24h、48h和72h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，MTT法檢測細胞生長抑制率。
　　3、特異性抑制survivin基因表達對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型放、化療的增敏作用。<

9、br>　　直接細胞懸液接種法在裸鼠皮下建立SGC7901-S1、SGC7901-NC和SGC7901三種胃癌細胞的移植瘤模型，對比不同胃癌細胞的成瘤能力。分別用2GyX線、2mg/kg順鉑和25mg/kg5-FU對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型進行放療和化療，通過測量、繪制移植瘤體積生長曲線，處死后稱取移植瘤瘤重，觀察抑制survivin基因表達對移植瘤放、化療的增敏作用。
　　4、特異性抑制survivin基因的表達對胃癌細胞化療增敏作

10、用的機制研究。
　　5ug/ml順鉑作用24h、48h和72h后，流式細胞儀PI單染色法檢測細胞周期變化，AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測細胞凋亡率，DNA瓊脂糖凝膠電泳分析、TUNEL染色檢測細胞凋亡改變。
　　【結果】
　　1．成功構建了survivinRNA干擾載體pEGFP-C1-S1、pEGFP-C1-S2和對照載體pEGFP-C1-NC；建立了3組穩(wěn)定轉染細胞系：SGC7901-S1、S

11、GC7901-S2、SGC7901-NC。
　　2．SGC7901-S1、SGC7901-S2細胞中survivinmRNA和蛋白表達均下調，尤其以pEGFP-C1-S1的干涉效果為好，其穩(wěn)定轉染細胞系SGC7901-S1中mRNA和蛋白表達的抑制率分別為：58.7％和55.8％。
　　3．隨X線放射治療的照射劑量升高，SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901細胞的克隆形成率出現(xiàn)下降。同一劑量照射下，SGC

12、7901-S1細胞的克隆形成率較其他細胞顯著降低，細胞存活曲線顯示：SGC7901-S1D0、Dq值顯著下降，分別為：2.457、1.471，其放射增敏比（SER）分別為：1.176（D0值比）、1.347（Dq值比）；2GyX線照射后各組細胞的凋亡率和生長抑制率隨著時間的延長有著明顯的提高，各檢測點SGC7901-S1細胞凋亡率和生長抑制率明顯高于其它兩組細胞。
　　4．隨著順鉑、5-FU藥物濃度升高，SGC7901-S1、SG

13、C7901-NC、SGC7901細胞的存活率出現(xiàn)下降。在同一藥物濃度下，SGC7901-S1細胞存活率下降更明顯。MTT法測得順鉑處理72小時的IC50值為5.61±0.32ug/ml，5-FU處理72小時的IC50值為8.91±0.39ug/ml。隨著時間的延長，5ug/ml順鉑或10ug/ml5-FU處理后的細胞凋亡率和生長抑制率出現(xiàn)增加，各檢測點SGC7901-S1的細胞凋亡率和生長抑制率明顯高于SGC7901-NC、SGC790

14、1細胞。
　　5．成功建立3組人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率100％。3組的平均成瘤時間分別為：SGC7901組裸鼠7.55±0.38天，SGC7901-NC組裸鼠7.38±0.48天，SGC7901-S1組裸鼠15.33±0.58天。
　　6．X線放療后不同檢測點接種SGC7901-S1組裸鼠腫瘤體積明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，腫瘤生長明顯受抑。觀察結束后，接種SGC7901-S1組裸鼠瘤重明顯小

15、于接種SGC7901-NC、SGC7901組，分別為1.623±0.248g、2.725±0.332g和2.831±0.356g（P<0.05）。
　　7．順鉑化療后不同檢測點接種SGC7901-S1組裸鼠腫瘤體積明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，腫瘤生長明顯受抑。觀察結束后，接種SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901組裸鼠瘤重分別為1.358±0.258g、2.782±0.371g和2.72

16、7±0.373g（P<0.05）。相似的情況也出現(xiàn)在5-FU化療后，觀察結束后，接種SGC7901-S1組裸鼠瘤重明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，分別為1.228±0.215g、2.753±0.347g和2.801±0.382g（P<0.05）。
　　7.流式細胞儀檢測化療后各組細胞的細胞周期發(fā)現(xiàn)，SGC7901-S1組細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，細胞比例明顯高于SGC7901-NC、SGC7901組。
　　

17、8．AnnexinV-FITC/PI雙標記檢測結果顯示，化療后SGC7901-S1組的凋亡比例明顯高于SGC7901-NC、SGC7901組。
　　9.DNA瓊脂糖凝膠電泳分析SGC7901組細胞核的DNA裂解為大小約為180-200bp（及其整數(shù)倍）的寡核苷酸片斷，電泳圖譜呈現(xiàn)明顯的階梯狀(DNAladder)。
　　10．TUNEL熒光染色法檢測細胞凋亡，SGC7901-S1組陽性細胞的數(shù)量明顯增加，表現(xiàn)為細胞核內(nèi)出現(xiàn)強

18、的黃綠色熒光。
　　【結論】
　　1．成功構建并篩選出干涉效果較好的survivinRNA干涉載體，并篩選出相應的人胃癌穩(wěn)定轉染細胞系SGC7901-s1，經(jīng)檢測其對survivin基因mRNA和蛋白的表達干擾效果較好。
　　2．體外實驗證明，特異性抑制survivin基因的表達可顯著增強胃癌細胞SGC7901對X線放射治療和順鉑、5-FU化療的敏感性。
　　3．成功建立3組人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過體內(nèi)實驗

19、證明，特異性抑制survivin基因的表達可增強X線放射治療和順鉑、5-FU化療對移植瘤的生長抑制，提高移植瘤的放、化療敏感性。
　　4．特異性抑制胃癌細胞survivin基因的表達后，化療細胞出現(xiàn)了顯著的G2/M期阻滯和凋亡現(xiàn)象，說明抑制survivin的表達對胃癌細胞放、化療增敏作用的機制，可能跟survivin調控細胞周期進程、誘導凋亡的作用有關。這為今后明確survivin的調控細胞凋亡的作用及影響放化療敏感性等通路中的可