shRNA特異性抑制胃癌SGC7901細胞NRAGE基因的表達.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是將雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)導入細胞內(nèi)引起同源mRNA降解的一種細胞反應過程。dsRNA進入細胞后被特異性dsRNA核酸酶(Dicer)切割成多個2卜23nt的短干擾RNA(shortinterferingRNA，siRNA)，siRNA與一些核酸酶結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合體(RNA—inducedsilencingcomplex，RISC)，由R

2、ISC介導同源mRNA的降解，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing，PTGS)。短發(fā)夾狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)由短的正義鏈、反義鏈(19—2Int)和連接它們的數(shù)個堿基組成，正義鏈、反義鏈呈反向重復序列，因其形似發(fā)夾而得名。1998年被發(fā)現(xiàn)以來，作為有力工具，RNAi技術已廣泛被用于白血病、病毒性肝炎、大腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌等多種人類腫瘤的研究，但應用

3、其研究胃癌近年才見報道。 NRAGE基因是1999年發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤抗原編碼基因(MAGE)中的MAGE-D亞族中的新成員，又名MAGE—Dl和Dlxin-1。不同于MAGE家族多在腫瘤和胚胎組織中表達，NRAGE基因在胚胎組織、腫瘤組織中以及正常組織中都有表達。在神經(jīng)組織、胚胎組織中NRAGE蛋白與P75~R神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體相互作用，通過JNK依賴的線粒體途徑誘導caspase激活和促進細胞凋亡，是一個凋亡誘導子。此外，NRAG

4、E作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子與dlx向sx轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用，參與細胞周期的調(diào)控。近來，國內(nèi)有報道NRAGE基因還參與胰腺癌PANC．1細胞間的黏附作用。今天，NRAGE基因越來越多的作用和功能被發(fā)現(xiàn)，但是應用RNAi方法研究NRAGE基因在胃癌中的表達較少見報道。 本研究應用RNAi技術干預胃癌SGC7901細胞NRAGE基因的表達，通過盯一PCR檢測抑制后NRAGE基因表達情況，用FCM、MTT等方法從反效應揭示NRAGE基因的功能，

5、研究NRAGE基因在胃癌SGC7901細胞中發(fā)生發(fā)展中的作用，為今后進一步揭示NRAGE基因功能和作用機制提供實驗依據(jù)。 材料與方法 1．細胞培養(yǎng) SGC7901用RPMll640培養(yǎng)基，置于37*(2，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該培基含10％胎牛血清，lOOu/m1青霉素，100μg／m1鏈霉素。轉(zhuǎn)染前改用雙無培養(yǎng)基RPMll640。 2．對照組質(zhì)粒的制備及pSUPER-EGFP—NRG的鑒定 用

6、EcoRI和HindlII~酶切已構(gòu)建好的pSUPER-EGFP—NRG載體，1％的瓊脂糖凝膠電泳回收質(zhì)粒片段，用Klenow大片段和T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌TGl中，鋪板后Kana抗性篩選。陽性克隆用化HpaI單酶切，1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將連接好的質(zhì)粒命名為pSUPER-EGFP。同時將質(zhì)粒pSUPER—EGFP—NRG測序。 3．優(yōu)化質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后的G418濃度 把SGC7901轉(zhuǎn)入6孔板中，細胞

7、數(shù)為1×lOs個。按200ug／ml、400ug／m1、600ug／m1、800ug／m1、1000μg／m1的G418濃度梯度加入G418，以3—5d后對照組細胞全部死亡的G418濃度為標準濃度。設立對照組。 4．質(zhì)粒的純化與轉(zhuǎn)染 用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提pSUPER-EGFP-NRG與pSUPER—EGFP，把SGC7901細胞隨機分為實驗組、實驗對照組、空白對照組，用Lifectaminem2000轉(zhuǎn)染試劑將p

8、SUPER-EGFP-NRG轉(zhuǎn)入實驗組細胞、將pSUPER-EGFP轉(zhuǎn)入實驗對照組細胞、空白對照組細胞中僅轉(zhuǎn)入脂質(zhì)體Lifectanine~2000，24h后換完全培養(yǎng)基RPMll640。 5．篩選與擴增 將轉(zhuǎn)染后的細胞在37~C、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后，待細胞鋪滿培養(yǎng)板后，按1：5的密度比例傳代至新的6孔培養(yǎng)板，并設立對照組。次日，更換為含況，4d后，待對照組細胞全部死亡后，更換為完全培養(yǎng)基RPMll640

9、。待陽性細胞克隆形成后，用200μl的Tip挑入24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)板后，移入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。 6．轉(zhuǎn)染后檢測：RT—PCR、流式細胞術、btTT比色法檢測細胞內(nèi)NRAGE的表達和癌細胞生長情況。 7．統(tǒng)計方法：應用SPSS11．0統(tǒng)計學軟件和方差分析來分析比較各組實驗數(shù)據(jù)。P

10、與實驗對照組、空白對照組處于Gl期的細胞相比有顯著差異，(F=69．35，P<0．05)；實驗組處于S期的細胞明顯多于實驗對照組與空白對照組細胞，且與實驗對照組、空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(F：64．34，P<0．05)；實驗組處于G2期的細胞明顯少于實驗對照組與空白對照組細胞，且與實驗對照組、空白對照組相比有顯著差異(F=8．99，P<0．05)，(2)調(diào)亡檢測結(jié)果：實驗組細胞未測到調(diào)亡指數(shù)，而實驗對照組、空白對照組調(diào)亡指數(shù)分別為6．

11、93±0．¨55和7．87±0．0578。實驗組細胞調(diào)亡現(xiàn)象不明顯。 2．半定量RT一PCR檢測結(jié)果 pSUPER—EGFP—NRG／SGC7901和pSUPER-EGFP／SGC7901和SGC7901中的NRAGE及B—action基因PCR擴增產(chǎn)物長度分別為567nt和315nt，與理論上的NRAGE及B—action產(chǎn)物長度相符。條帶的灰度值(NRAGE／B—action)均值分別為0、0．1503±0．0049

12、5、O．1575±0．01072。實驗組比值較對照組有顯著差別(P<0．05)。實驗對照組較空白對照組無顯著差別(p>O．05)。說明NRAGE基因在胃癌組織中表達量較低且實驗組中的NRAGE基因幾乎全部被抑制。 3．MTT檢測結(jié)果 24hpSUPER-EGFP—NRG／SGC7901和pSUPER—EGFP／SGC7901細胞存活率分別為1．085±0．179；1．051±0．294。48h細胞存活率分別為1．350±

13、0．357：1．037±0．291。96h細胞存活率分別為1．736±0．134；1．038±0．267。兩實驗組細胞轉(zhuǎn)染后每天所測存活率均顯著高于對照組(P