肝癌特異性靶標致敏DC誘導CIK對肝癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的:抗原負載或刺激DC細胞，能夠增強DC的免疫性及抗原提呈作用，然后再將DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)，可以使DC-CIK細胞發(fā)揮更好的特異性抗腫瘤作用。體外培養(yǎng)DC關鍵一步是選擇何種形式的抗原來刺激DC，目前臨床應用的DC細胞主要是利用手術切除腫瘤組織的裂解產物沖擊致敏DC。采用腫瘤組織凍融裂解物可以有效促進DC的成熟，但是對于不能手術的晚期腫瘤病人，得不到相應的腫瘤抗原，因而不能誘導產生腫瘤特異性的DC，這樣就妨礙了DC細胞臨床應用的

2、范圍。通過對DC抗原提呈原理的分析可知，DC對腫瘤抗原的提呈過程是將完整的抗原在胞漿中降解成多肽，多肽轉移至內質網(wǎng)腔內與新組裝的MHC-Ⅰ類分子結合，而后通過高爾基體轉移到細胞表面，細胞表面MHC-Ⅰ類分子結合的多肽被免疫性識別，從而導致效應細胞的活化。由此可見，DC提呈的是多肽，效應細胞識別的也是多肽。特異性腫瘤遞呈靶標就是多條腫瘤組織特異性抗原肽的復合物，其是經(jīng)過龐雜的程序從腫瘤組織中篩選出來的腫瘤特異的、確定性的靶標序列。本研究即

3、是通過用肝癌特異性腫瘤遞呈靶標致敏DC后與CIK共培養(yǎng)后對HuH-7肝癌細胞進行體內外殺傷和抑制來觀察其療效，探求特異性腫瘤遞呈靶標致敏DC的臨床可行性和應用價值。
　　方法:
　　1.從健康人外周血中密度梯度離心分離外周血單個核細胞，貼壁培養(yǎng)后收集貼壁細胞，利用IL-4、GM-CSF細胞因子刺激培養(yǎng)DC，分別利用肝癌特異性DC靶標或者肝癌HuH-7細胞凍融抗原沖擊致敏DC。檢測DC表面標志成熟的分子CD80、CD83、CD

4、86、HLA-DR以及單核細胞標志CD14的表達情況，評價DC成熟程度;ELISA法檢測DC細胞培養(yǎng)上清中細胞因子分泌水平的差異。
　　2.從健康人外周血中密度梯度離心分離外周血單個核細胞，貼壁培養(yǎng)后收集懸浮細胞，利用IFN-γ，CD3 mAb、IL-2、IL-1α等細胞因子刺激培養(yǎng)CIK。CIK細胞與經(jīng)不同種類腫瘤抗原致敏的DC混合培養(yǎng)，檢測CIK細胞表面CD3、CD56分子的表達情況，ELISA法檢測效應細胞因子IFN-γ的分

5、泌水平的差異。
　　3.培養(yǎng)HuH-7肝癌細胞，利用不同組CIK細胞作用于HuH-7細胞24小時后，去除懸浮的效應細胞，CCK-8試劑檢測貼壁的靶細胞存活情況，比較單純CIK細胞、肝癌特異性DC靶標致敏DC誘導的CIK細胞以及肝癌HuH-7細胞凍融抗原致敏DC誘導的CIK細胞對肝癌細胞殺傷活性的不同。
　　4.裸鼠皮下注射HuH-7細胞懸液構建裸鼠肝癌移植瘤模型，DC-CIK細胞由尾靜脈注入荷瘤裸鼠，觀察荷瘤裸鼠腫瘤體積的變

6、化，比較不同種類腫瘤抗原致敏DC后對荷瘤裸鼠的抑瘤作用的不同。
　　結果:
　　1.負載腫瘤抗原后，DC細胞分泌IL-12 p70顯著增強。利用肝癌特異性DC靶標致敏后，DC培養(yǎng)上清IL-12 p70分泌量為173.33±6.66 pg/ml，與HuH-7細胞凍融抗原致敏的DC分泌水平179.33±14.04 pg/ml相似，明顯高于對照組59.33±11.84 pg/ml。DCHuH-7 vs control，P＜0.01

7、;DCtarget vscontrol，P＜0.01。
　　2.與負載肝癌特異性DC靶標的DC共培養(yǎng)和與負載肝癌細胞凍融抗原的DC共培養(yǎng)一樣均可以顯著增強CIK細胞分泌IFN-γ的能力，前者IFN-γ分泌量為345±22.34 pg/ml，后者IFN-γ分泌量為380.67±10.11 pg/ml，和單獨培養(yǎng)的CIK對照組（166.67±11.23 pg/ml）比較，P值均＜0.01。負載肝癌特異性靶標抗原的DC作用稍弱（DCHu

8、H-7 vs DCtarget，P＞0.05）。
　　3.用CCK-8法測定在10∶1、20∶1、40∶1和100∶1四種效靶比下不同培養(yǎng)方式的CIK細胞對肝癌細胞HuH-7的殺傷活性。結果顯示，隨著效靶比的增加，各組CIK細胞對靶細胞HuH-7的殺傷活性均逐漸增強。在同一個效靶比中，對HuH-7細胞的殺傷活性強弱排序為:DCHuH-7-CIK細胞＞ DCtarget-CIK細胞＞CIK細胞。DCHuH-7-CIK細胞組以及DCt

9、arget-CIK細胞對HuH-7細胞株的殺傷活性明顯高于單純CIK細胞(P＜0.05)，但DCHuH-7-CIK組與DCtarget-CIK組比較差異不顯著(P＞0.05)。
　　4.測定不同培養(yǎng)方式的CIK細胞對裸鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用。CIK細胞治療組平均抑瘤率為54.69％，DCHuH-7-CIK細胞治療組平均抑瘤率為85.78％，DCtarget-CIK細胞治療組平均抑瘤率為78.48％。CIK、DCHuH-7-CIK以

10、及DCtarget-CIK三組細胞都能明顯抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長，瘤結節(jié)增大的速度放緩，與未經(jīng)治療的對照組相比，CIK治療組P值＜0.05，DCHuH-7-CIK治療組及DCtarget-CIK治療組P值均＜0.01。DCtarget-CIK細胞對腫瘤的抑制作用與DCHuH-7-CIK細胞相仿(P=0.998＞0.05)。
　　結論:
　　1.肝癌特異性DC靶標可成功致敏DC。負載肝癌特異性DC靶標后，DC細胞分泌IL-1

11、2 p70顯著增加;與其共培養(yǎng)后，DC-CIK細胞分泌效應細胞因子IFN-γ的能力明顯提高。
　　2.體外實驗證實，負載肝癌特異性DC靶標的DC細胞可明顯提高CIK細胞對肝癌細胞株HuH-7的殺傷活性。
　　3.體內實驗表明，負載肝癌特異性DC靶標的DC細胞可明顯提高CIK細胞對裸鼠體內肝癌移植瘤的抑制作用。
　　4.在臨床患者不能或不易獲取腫瘤抗原時，肝癌特異性靶標可替代肝癌組織抗原負載DC進行細胞治療，能夠取得與腫