索拉非尼聯合順鉑對人肝癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、近年來，隨著肝癌分子生物學的研究深入，分子靶向治療研究正逐漸成為肝癌治療的新手段。分子靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑已經在多種腫瘤的臨床試驗中取得另人鼓舞的效果。其中多靶點藥物索拉非尼(Sorafenib，Nexavar，BAY43-9006)在晚期肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的治療中取得確切的療效。 索拉非尼是一種口服的小分子激酶抑制劑，一項國際多中心III期隨機對照治療HCC的SHARP研

2、究結果顯示索拉非尼能延長晚期HCC患者的生存期。該研究結果被認為是首次發(fā)現能延長HCC存活期的藥物，并認為索拉非尼可視為晚期HCC的一線治療藥物。2007年11月，美國FDA已經批準索拉非尼治療不能手術切除的HCC。 傳統(tǒng)化療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)的抗腫瘤作用顯著，抗腫瘤活性強，抗腫瘤譜廣，臨床廣泛應用于多種實體瘤的治療。本研究旨在探討索拉非尼與DDP聯合對HCC的聯合抑制作用，并探討其可能機制，為肝癌的綜合治療

3、、提高療效提供理論基礎。 第一部分：索拉非尼聯合DDP對人肝癌HepG2細胞抑制作用的實驗研究 一、材料與方法 1.HepG2細胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5天傳一次代，選擇對數生長期細胞作為實驗用。 2.將細胞分成4組，分別為空白對照組、索拉非尼單藥組、DDP單藥組、索拉非尼聯合DDP組。檢測細胞增殖抑制率時索拉非尼藥物濃度分別為2、4、8、16μmol／L；DDP藥物濃度

4、分別為3、6、12、24μmol／L；索拉非尼聯合DDP組藥物濃度是2+3、4+6、8+12μmol／L。流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡及Westem-blot檢測蛋白(ERK、pERK、CyclinD1及p21WAF1／CIP1蛋白)時，組中藥物濃度索拉非尼均為4μmol／L，DDP均為6μmol／L。 3.采取上述分組，用MTT法檢測藥物對人肝癌HepG2細胞增殖的抑制，根據OD值計算細胞生長抑制率。 4.采用協同作用

5、q值判斷索拉非尼和DDP聯用的性質：q>1.15為協同作用，0.85≤q≤1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用。 5.采取上述分組，收集細胞用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。 6.采取上述分組，收集細胞，提取蛋白行Western-blot檢測ERK、pERK、CyclinD1及p21WAF1/CIP1蛋白的表達。 7.統(tǒng)計處理：實驗結果以均數士標準差(-x±s)表示，數據處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，各組

6、間細胞抑制率比較采用重復測量方差分析；細胞周期、細胞凋亡率及蛋白表達IOD值采用單向方差分析；多重比較均采用LSD檢驗。P<0.05(雙側)表示差異有顯著性。 二、結果 1.索拉非尼、DDP單藥對人肝癌HepG2細胞的生長抑制作用 經MTT法檢測示，不同濃度索拉非尼對人肝癌均有抑制作用，隨濃度增高及時間延長抑制率增強(P均<0.001)。DDP對人肝癌HepG2細胞的抑制作用亦具有時間及劑量依賴效應(P均<0.0

7、01)。 2.索拉非尼和DDP不同濃度單獨及聯合對人肝癌HepG2細胞的抑制作用 經MTT法檢測示，各濃度單獨和聯合應用對細胞的抑制率有顯著性差異(P<0.001)；各濃度聯合組與相應濃度索拉非尼或DDP單藥組相比，抑制率均有顯著性差異(P<0.001)，聯合組療效均優(yōu)于單藥組(P<0.001)。 3.索拉非尼和DDP不同濃度聯合作用的q值 索拉非尼2μmol／L和DDP3μmol/L聯合用藥組在24小時

8、未顯示出相加作用，48和72小時表現為相加作用。索拉非尼4μmol/L和DDP8μmol/L聯合用藥組在各個時間點均顯示相加作用(0.85≤q≤1.15)。索拉非尼8μnol／L和DDP12μmol／L聯合用藥組于24和48小時未出現相加作用，至72小時表現為相加作用。 4.索拉非尼、DDP單藥及聯合用藥對人肝癌HepG2細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期示，與對照組相比，索拉非尼及DDP單藥作用均可使細胞周期阻滯于

9、G0／G1期(P=0.002，0.032)。聯合用藥組G0／G1期細胞比率高于索拉非尼及DDP單藥組(P=0.025，0.002)，S期細胞比率低于單藥組(P=0.004，0.022)。 5.索拉非尼、DDP單藥及聯合用藥對人肝癌HepG2細胞凋亡的作用 索拉非尼或DDP單藥作用后經流式細胞儀檢測，細胞凋亡率均較對照組升高(P=0.006，0.036)。與索拉非尼(21.18％)和DDP(16.45％)單藥組相比，聯合用

10、藥組凋亡率升高更為明顯，達35.28％(P=0.007，0.001)。 6.索拉非尼、DDP單藥及聯合用藥對人肝癌HepG2細胞ERK及pERK蛋白表達的影響 Western-blot檢測結果示，單藥及聯合用藥組對HepG2細胞ERK總蛋白的表達無影響，而pERK蛋白在索拉非尼組及聯合用藥組的表達均較對照組降低(P<0.001)，以聯合組尤甚；DDP組與對照組條帶表達無差異(P=0.173)。 7.索拉非尼、DD

11、P單藥及聯合用藥對蛋白的影響 經Western-blot檢測示，索拉非尼組和聯合組的CyclinD1條帶表達低于對照組(P<0.001，P=0.001)，DDP組和對照組條帶無顯著性差異(P=0.509)。對照組和索拉非尼組p21WAF1／CIP1蛋白的表達低；DDP組及聯合組條帶表達未見差異(P=0.734.)，兩者均較對照組表達增強(P=0.001)。 三、結論： 1.索拉非尼及DDP單藥對人肝癌HepG2細

12、胞都有增殖抑制作用。 2.索拉非尼與DDP聯用具有療效相加作用。 3.索拉非尼和DDP單藥或聯合能誘導細胞周期阻滯及凋亡，以聯合時更顯著。 4.索拉非尼通過RAF／MEK／ERK途徑下調CyclinD1的表達，而DDP通過p53途徑上調的p21WAF1／CIP1蛋白的表達，導致細胞周期阻滯；與單藥相比，兩藥聯用從多個途徑引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，增強了抗腫瘤效果。 第二部分：索拉非尼聯合DDP抑制人

13、肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的實驗研究 一、材料與方法 1.建立人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型：0.2ml人肝癌HepG2細胞(對數生長期)懸液接種裸鼠，每只裸鼠注射部位為裸鼠右腋下部皮下，注射腫瘤細胞懸液(0.2ml／只)，含活細胞5×106／0.2ml。 2.實驗分組：將已成瘤小鼠(瘤重約130-150mg)隨機分成空白對照組、溶劑對照組、索拉非尼組、DDP組和聯合用藥組共五組，每組10只。各組裸鼠于治療起第

14、21天處死。 3.給藥：索拉非尼組給予索拉非尼30mg／kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，共12天。DDP組給予4mg／kg，腹腔注射0.2ml，每4天一次，共3次，聯合用藥組中索拉非尼給予30mg／kg，DDP給予4mg／kg，兩種藥物于同一天開始給藥，早上給予索拉非尼，下午給DDP，時間間隔為3-5小時。 4.裸鼠腫瘤大體形態(tài)觀察，并測定裸鼠體重、腫瘤大小及計算瘤重：每只裸鼠在給藥第1天開始測體重和腫瘤大小，每星期

15、測兩次。瘤重根據公式：(1×w2)／2，1指腫瘤的長徑；w指腫瘤的短徑。 5.療效及毒性評價：療效以完全緩解(completeremission，CR)、部分緩解(partialremission，PR)和腫瘤生長抑制(tumorgrowthinhibition，TGI)來評價。毒性評價：以超過20％裸鼠死亡和／或體重減輕(去除瘤重)超過20％稱為毒性大。 6.腫瘤組織HE染色并置于顯微鏡觀察。 7.統(tǒng)計處理：實

16、驗結果以均數士標準差(-x±s)表示，數據處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，各組腫瘤瘤重比較采用重復測量方差分析，多重比較均采用LSD檢驗。P≤0.05(雙側)表示差異有顯著性。 二、結果： 1.觀察裸鼠移植瘤大體形態(tài)發(fā)現，各治療組腫瘤生長慢于對照組，以聯合組腫瘤生長最慢。治療后第21天處死的瘤體組織，對照組腫瘤體積最大，聯合用藥組腫瘤體積最小。切開腫瘤組織，對照組及DDP組腫瘤周邊組織血供較豐富，而索拉非尼組及聯合用藥

17、組小血管較少。 2.各治療組與對照組相比療效均有顯著性差異，P<0.001；聯合用藥組療效優(yōu)于索拉非尼及DDP單藥組(P=0.003，P<0.001)。 3.每組均未有超過20％的死亡率，體重亦未減少超過20％。溶劑對照組、DDP組及聯合用藥組各死亡1只，索拉非尼死亡2只。各組未出現CR，其中索拉非尼單藥組及聯合用藥組各出現1例PR。索拉非尼及DDP單藥的TGI分別為46.43％和38.45％，聯合用藥組TGI達60.4