貝伐單抗聯(lián)合順鉑對(duì)VEGF高表達(dá)的荷卵巢癌裸鼠腹水抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 卵巢癌具有腹膜內(nèi)種植轉(zhuǎn)移的特征。研究證實(shí)血管滲透性因子(Vascular permeability factor，VPF)，又名血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)在卵巢癌腹水形成中起關(guān)鍵作用。惡性腹水通常是腫瘤的晚期表現(xiàn)。一旦發(fā)生，患者的中位生存期大約僅為數(shù)周至數(shù)月，而一年生存率一般不超過(guò)10％?，F(xiàn)階段，針對(duì)惡性腹水的治療手段較多，包括全身化療、腹腔灌注化療

2、、放療、腹腔內(nèi)注射放射性同位素或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等。雖然獲得了一定療效，但是，迄今為止還沒有哪一種方法的療效完全令人滿意，同時(shí)往往還造成患者生存嚴(yán)重下降。因此，如何對(duì)這部分患者進(jìn)行恰當(dāng)?shù)呐R床干預(yù)以使其有較好的生存質(zhì)量，是目前臨床腫瘤工作者面臨的重要任務(wù)。 癌性腹水的發(fā)生機(jī)制與肝硬化腹水的發(fā)生機(jī)制相比，有顯著的不同。在肝硬化腹水形成中，患者體內(nèi)水鈉滁留、低蛋白血癥是造成腹水的主要原因；而對(duì)于癌性腹水，早先曾認(rèn)為是膈下淋巴叢引流減少所

3、導(dǎo)致，但是近來(lái)的研究表明，腫瘤局部分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，又名血管滲透性因子(VPF)，作用于腹膜及新生血管導(dǎo)致其通透性增強(qiáng)才是形成癌性腹水的主要原因。以VEGF為靶點(diǎn)，抑制新生血管形成和腹膜滲透性，減少腹水生成，可能成為治療癌性腹水的新策略。目的本研究擬建立VEGF高表達(dá)的荷卵巢癌裸鼠腹水模型，觀察貝伐單抗(抗-VEGF單克隆抗體)對(duì)卵巢癌腹水生成的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。研究貝伐單抗(Bevaci Zumab)聯(lián)合化

4、療藥物順鉑(DDP)對(duì)裸鼠腹水生成的聯(lián)合效用，以其提高腹水治療的靶向性，尋找更有效的生物化療治療腹水的臨床方法。 實(shí)驗(yàn)方法 1、對(duì)人卵巢癌細(xì)胞OVCAR3和HEY-A8腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并用RT-PCR方法測(cè)定其細(xì)胞VEGF和OVCAR3細(xì)胞VEGFR的表達(dá)。 2、用兩種細(xì)胞株進(jìn)行腹腔內(nèi)接種，觀察腹水形成情況，用貝伐單抗和化療藥物順鉑對(duì)成腹水的裸鼠進(jìn)行干預(yù)。 3、用ELISA法測(cè)定腹水中VPF/VE

5、GF的含量，用5％的Evan藍(lán)從裸鼠尾靜脈注入后，用酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)檢測(cè)Evan藍(lán)的吸光度，通過(guò)檢測(cè)吸光度值間接反映Evan藍(lán)的濃度，從而分析腹膜滲透性。 4、用CD34抗體標(biāo)記檢測(cè)微血管密度來(lái)研究貝伐單抗、順鉑對(duì)VEGF高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞實(shí)體瘤血管生成的影響。 5、收集臨床腹水標(biāo)本，用ELISA法測(cè)定腹水中VEGF 的含量，從臨床患者腹水中VPF/VEGF濃度的具體情況來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證VEGF 在腹水生成中的重要作用

6、。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件中完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單向方差分析(One-way ANOVA)，多組間比較采用LSD法。臨床標(biāo)本部分患者年齡、兩組患者腹水中VEGF含量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 結(jié)果 l、OVCAR3和HEY-A8細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。OVCAR3和HEY-A8細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞成團(tuán)塊生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞體積大，OVCAR3細(xì)胞圓形透亮；HEY-A8呈分葉狀

7、，透光度非常好。分別用RT-PCR方法進(jìn)行VEGF的定性檢測(cè)，結(jié)果表明OVCAR3細(xì)胞VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；HEY-A8不表達(dá)VEGF。2、兩種人卵巢癌細(xì)胞株裸鼠腹水模型的建立。分別用兩種細(xì)胞株進(jìn)行腹膜內(nèi)接種，裸鼠(5至7周齡)腹腔內(nèi)注射OVCAR3細(xì)胞懸液(共48只，每只注射體積200ul，含5×10<'6>個(gè)細(xì)胞)。另外，將HEY-A8卵巢癌細(xì)胞株接種至12只裸鼠腹膜腔內(nèi)(每只200ul，含2×10<'6>個(gè)細(xì)胞)，接種后觀察腹部膨

8、隆和體重變化。OVCAR3細(xì)胞種植后2周，裸鼠開始出現(xiàn)腹部膨隆，提示腹水形成。尸解后，OVCAR3裸鼠腹腔內(nèi)可見腹水生成，并見腹膜、腸道、腸系膜和子宮的表面散在的瘤結(jié)節(jié)，而HEY-A8裸鼠無(wú)腹部膨隆等癥狀出現(xiàn)，無(wú)腹水形成。 3、貝伐單抗、順鉑和貝伐單抗聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠腹水瘤的作用。分別測(cè)定腹水體積、腹水中VEGF含量、腹膜滲透性(0D值)、腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)、及腹膜內(nèi)實(shí)體瘤組織的微血管密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三個(gè)治療組對(duì)腹水皆有抑制作用

9、，貝伐單抗組，順鉑組，聯(lián)合治療組裸鼠腹水體積分別為：2.36±0.34，3.62±0.31，1.82±0.40；以貝伐單抗組和聯(lián)合治療組作用顯著，尤以聯(lián)合治療組效果明顯(p=0.000；p<0.05)；腹水中紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分別在10<'7>個(gè)/ml和10<'6>個(gè)/ml水平以上，對(duì)照組紅細(xì)胞為78.83±7.63，貝伐單抗組，順鉑組、聯(lián)合治療組分別為49.33±6.15，63.67±9.83，34.00±14.27，各治療組跟對(duì)照組相

10、比差異明顯，尤以聯(lián)合治療組差異顯著(p=0.000；p<0.05)；各治療組跟對(duì)照組相比，腹水中紅細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(p=0.000；p<0.05)；對(duì)照組中腫瘤細(xì)胞為77.00±6.60；貝伐單抗組，順鉑組，聯(lián)合治療組分別為56.67±4.68，67.83±6.88，40.33±9.59，各治療組跟對(duì)照組相比差異明顯，尤以聯(lián)合治療組差異顯著(p=0.000；p<0.05)；貝伐單抗組、順鉑組、聯(lián)合治療組和對(duì)照組的腹水中VEGF濃度分別

11、為193.3±10.09、402.0±11.59、138.8±10.28和411.2±10.80，貝伐單抗組較順鉑組和對(duì)照組明顯減少腹水中VEGF含量；順鉑組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(p=0.154，p>0.05)；而貝伐單抗和順鉑的聯(lián)合治療可加強(qiáng)對(duì)腹水中VEGF含量的抑制(p=0.000；p<0.05)。在腹膜滲透性方面，結(jié)果顯示貝伐單抗組腹膜滲透性的0D值明顯低于順鉑組和對(duì)照組(p=0.000；p<0.05)，順鉑組和對(duì)照組及貝伐單抗

12、組與聯(lián)合治療組之間無(wú)明顯差異(p=0.078；p>0.05)，說(shuō)明貝伐單抗可明顯改善腹膜滲透性，順鉑對(duì)腹膜滲透性無(wú)明顯影響。4、貝伐單抗、順鉑和貝伐單抗聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤組織微血管密度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照組MVD的平均值為33.00±3.74；順鉑組MVD平均值為31.50±3.08；貝伐單抗治療組MVD平均值為21.67±2.73；聯(lián)合治療組MVD平均值為16.83±2.48。順鉑組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(p=0.404，p>0.0

13、5)；貝伐單抗和聯(lián)合治療組之問(wèn)顯著差異(p=0.000；p<0.05)；貝伐單抗和聯(lián)合治療組較對(duì)照組和順鉑組顯著降低其微血管密度(p=0.000；p<0.05)。 5、臨床患者腹水的VEGF含量說(shuō)明VEGF在腹水形成中的關(guān)鍵作用。惡性腹水和非惡性腹水中VEGF水平分別為(1294.9±761.9)pg/ml、(224.6±198.6)Pg/ml，兩者具有顯著性差異(p=0.000；p<0.05)。 結(jié)論 l、高V

14、EGF 表達(dá)的OVCAR3及不表達(dá)的HEY-A8之間在致腹水能力上存在差異，可能與VEGF表達(dá)差異有關(guān)。 2、在OVCAR3腹水瘤模型中，經(jīng)貝伐單抗，順鉑、貝伐單抗和順鉑聯(lián)合干預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，貝伐單抗聯(lián)合順鉑能顯著抑制裸鼠腹水的生長(zhǎng)；減少腹水中的VEGF含量；降低腹膜滲透性及減少腹水中腫瘤細(xì)胞及紅細(xì)胞數(shù)，說(shuō)明貝伐單抗和順鉑聯(lián)合治療可加強(qiáng)對(duì)腹水的控制。 3、貝伐單抗聯(lián)合順鉑可明顯減少卵巢癌組織的MVD水平，說(shuō)明二者聯(lián)合可明顯抑