山羊NLRP3炎癥小體構(gòu)成蛋白組織特異性表達(dá)和分布研究.pdf

1、NLRP3(NOD-like receptor protein3)炎癥小體是胞漿內(nèi)由多種蛋白構(gòu)成的一種蛋白復(fù)合體，它主要包括NLRP3、ASC(Apoptosis-associated speck-like protein)和caspase-1(Cysteinyl aspartate-specific proteasws)這三種蛋白。其中NLRP3蛋白是胞漿內(nèi)重要的模式識(shí)別受體，能感知胞內(nèi)病原微生物產(chǎn)物及代謝性應(yīng)激，是構(gòu)成炎癥小體的核心

2、部分。NLRP3炎癥小體是半胱天冬蛋白酶活化所必需的反應(yīng)平臺(tái)，調(diào)控白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18等促炎細(xì)胞因子的加工及活化，參與天然免疫系統(tǒng)的激活。它還調(diào)節(jié)caspase-1依賴的程序性細(xì)胞調(diào)亡，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激的病理?xiàng)l件下死亡。本研究對(duì)海南黑山羊的NLRP3炎癥小體構(gòu)成蛋白的NLRP3和caspase-1基因進(jìn)行了克隆和序列分析，通過重組原核表達(dá)純化蛋白，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。采用實(shí)時(shí)

3、熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究了黑山羊各個(gè)組織中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平及蛋白的組織學(xué)分布。研究結(jié)果有助于闡明NLRP3炎癥小體在羊炎癥反應(yīng)中的作用以及炎癥小體的主要組成蛋白在體內(nèi)的相對(duì)分布情況，為進(jìn)一步探索NLRP3炎癥小體在不同物種中的功能和進(jìn)化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究共進(jìn)行了3部分研究，結(jié)果如下：
　　1.海南黑山羊NLRP3和caspase-1基因的克隆及序列分析
　　以海南黑

4、山羊肝臟總RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增了海南黑山羊的NLRP3和caspase-1基因，獲得的基因序列提交到GenBank（登錄號(hào)分別為KM236558、KP999980）。運(yùn)用分子生物學(xué)軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，所克隆的山羊NLRP3基因ORF長(zhǎng)3130bp，編碼1031個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為117.8kDa；caspase-1基因ORF長(zhǎng)1212bp，編碼403個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為45.3kDa。

5、>　　2.海南黑山羊NLRP3和caspase-1蛋白原核表達(dá)與多抗制備
　　分別以pMD18-T-NLRP3和pMD18-T-caspase-1為模板，擴(kuò)增出了帶有酶切位點(diǎn)的目的基因片段，亞克隆至表達(dá)載體PET32a(+)，通過雙酶切和序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了 pET32a(+)-NLRP3和 pET32a(+)-caspase-1表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析

6、表明這2種蛋白都成功誘導(dǎo)表達(dá)。通過SDS蛋白凝膠電泳檢測(cè)純化蛋白條帶大小分別約為130kDa和63kDa，與其預(yù)測(cè)的大小相一致。將純化后的蛋白制成油乳劑免疫新西蘭大白兔，制備兔抗山羊NLRP3與caspase-1多克隆抗體。間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明這兩種抗體效價(jià)均較高。用His標(biāo)簽抗體和免疫新西蘭大白兔制備的純化IgG抗體分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明制備的多抗特異性良好。
　　3.海南黑山羊NLRP3、ASC

7、和caspase-1基因和蛋白的組織學(xué)表達(dá)和分布的研究
　　以海南黑山羊各組織中總RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR方法分別擴(kuò)增了NLRP3、ASC、caspase-1、β-actin基因片段，溶解曲線分析NLRP3、ASC、caspase-1、β-actin基因片段引物的特異性。擴(kuò)增的目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在78bp、196bp、110bp和152bp處有一條相應(yīng)的特異性條帶，其大小與理論值相符。NLRP3、ASC和

8、caspase-1基因在山羊的各組織中均有表達(dá)。其中NLRP3基因mRNA在脾臟中表達(dá)量最高，顯著高于其他各檢測(cè)組織（P<0.05），而在大腦和淋巴結(jié)中表達(dá)量最低。ASC基因mRNA在肝臟中表達(dá)量最高，顯著高于其他各檢測(cè)組織（P<0.05），在脾臟的表達(dá)量次之，而在心臟、肺臟和淋巴結(jié)中表達(dá)量最低。caspase-1基因mRNA在肝臟和脾臟中表達(dá)量最高，顯著高于其他各檢測(cè)組織（P<0.05）；而大腦、腎臟和心臟的表達(dá)顯著低于其他組織（P<

9、0.05）。
　　利用制備的NLRP3和caspase-1多克隆抗體以及本實(shí)驗(yàn)室先前制備的ASC抗體，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)NLRP3、ASC和caspase-1蛋白在海南黑山羊各個(gè)組織的分布進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，海南黑山羊這NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的分布極其相似，在心臟和腦呈現(xiàn)弱至中強(qiáng)陽性反應(yīng)，但在肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)中呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。心肌細(xì)胞呈弱陽性至中強(qiáng)陽性，心肌間結(jié)締組織呈陰性；肝細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，部