單核苷酸多態(tài)性和miRNA對CARM1基因表達(dá)的調(diào)控機制及其在冠心病中的作用研究.pdf

1、第一部分單核苷酸多態(tài)性和miRNA對CARM1基因表達(dá)的調(diào)控機制及其在冠心病中的作用研究
　　 目的:
　　 闡明調(diào)控輔激活因子相關(guān)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(coactivator-associated argininemethyl-transferase1，CARM1)基因表達(dá)的分子機制，探索其通過何種作用方式參與冠心病的發(fā)生，試圖揭示該基因在冠心病發(fā)生中的作用及機制，為冠心病的預(yù)防和治療提供新的靶點。
　　 方法

2、:
　　 1)利用real-time PCR和Western blot方法分別在mRNA和蛋白水平上檢測冠心病病例和對照的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中CARM1的表達(dá)水平;2）綜合利用HapMap數(shù)據(jù)庫中連鎖不平衡(LD)分析和“DNA元件百科全書”(ENCODE)的功能注釋數(shù)據(jù)，篩選CARM1基因上下游10kb內(nèi)位于不同LD區(qū)域中的潛在功能性單核苷酸多態(tài)性（SNP）;在234例健康個體的PBMCs樣本中檢測CARM1 mR

3、NA的表達(dá)水平，分析其與SNP基因型的關(guān)系;對影響CARM1表達(dá)的SNP進行生物學(xué)功能研究:應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測等位基因特異性的轉(zhuǎn)錄激活活性，利用電泳遷移率變更實驗(EMSA)、多種轉(zhuǎn)錄因子冷競爭實驗(MC-EMSA)、電泳超遷移率變更分析(supershift-EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分別在體外和細(xì)胞內(nèi)篩選、鑒定等位基因特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;3）通過生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)控CARM1的靶miRNA;利用real-ti

4、me PCR檢測其在冠心病病例和對照中的表達(dá);通過共轉(zhuǎn)染野生型或種子區(qū)突變的CARM13'-UTR區(qū)報告基因及靶miRNA模擬物(mimics)證明該miRNA結(jié)合CARM13'-UTR種子區(qū);在細(xì)胞水平上過表達(dá)或敲減該miRNA，通過real-time PCR和Western blot檢測CARM1的mRNA和蛋白水平，明確其對CARM1表達(dá)的調(diào)控;4）通過CARM1的功能性多態(tài)位點與血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy

5、)水平的關(guān)聯(lián)研究，及細(xì)胞中過表達(dá)人源CARM1后ELISA檢測細(xì)胞上清及胞內(nèi)Hey的水平，探索CARM1對Hey盼調(diào)控作用;5）在1010例冠心病病例和3998例對照中進行CARM1的功能性位點與冠心病的關(guān)聯(lián)研究，使用加性模型分析少見等位基因?qū)谛牟“l(fā)生的效應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1)與對照組相比，急性冠脈綜合征(ACS)組PBMCs中CARM1的mRNA水平升高3.9倍，蛋白水平升高1.5倍;2）根據(jù)LD分析和ENC

6、ODE證據(jù)，篩選出4個潛在功能性SNP;在健康人群中3個SNP位點與CARM1的表達(dá)水平相關(guān)，即rs12460421(A/G)、rs117569851(T/C)和rs4804544(A/G)，其中后兩個位點完全連鎖;報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，rs12460421-rs117569851單體型GC和單體型AT的轉(zhuǎn)錄活性分別是單體型GT的2.0倍和1.7倍;EMSA結(jié)果顯示rs12460421的A等位基因與核蛋白的結(jié)合能力強于G，rs11756

7、9851的C等位基因與核蛋白的結(jié)合能力強于T;MC-EMSA篩選出轉(zhuǎn)錄因子Egr-1與這兩個位點結(jié)合;supershift-EMSA和ChIP實驗分別在體外和細(xì)胞內(nèi)水平證明Egr-1結(jié)合這兩個位點且不同等位基因與Egr-1的親和力不同;3）生物信息學(xué)預(yù)測與CARM1結(jié)合的靶miRNA為miR-15a和miR-16;與對照組相比，ACS病例組的PBMCs中miR-15a的表達(dá)水平降低37％，而miR-16則表達(dá)升高;野生型和突變型CARM

8、13'-UTR的報告基因與miR-15amimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示miR-15a與CARM13'-UTR的兩個種子區(qū)都發(fā)生結(jié)合;在293T細(xì)胞中過表達(dá)miR-15a不引起CARM1下調(diào)，但敲減miR-15a后CARM1表達(dá)增加;4）在健康人群中，CARM1的功能性多態(tài)位點rs117569851與血漿Hcy水平存在關(guān)聯(lián)(P=0.02)，每增加一個少見等位基因T，Hcy的水平降低2.16μmol/L;5）rs11

9、7569851與冠心病的關(guān)聯(lián)研究未檢出統(tǒng)計學(xué)差異（校正年齡、性別、BMI后P=0.053）。
　　 結(jié)論:
　　 1) ACS患者PBMCs中CARM1基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)水平升高，提示該基因在冠心病的發(fā)生中可能起重要作用;
　　 2) CARM1啟動子區(qū)功能性多態(tài)位點rs117569851的少見等位基因T通過降低與轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的結(jié)合，下調(diào)CARM1的表達(dá)，降低血漿Hey水平，從而可能潛在減少冠心病

10、的發(fā)病風(fēng)險;
　　 3) miR-15a在ACS患者PBMCs中表達(dá)下降，減輕了對CARM1 mRNA的降解和蛋白翻譯的抑制作用，從而使CARM1的表達(dá)水平升高;
　　 4)關(guān)聯(lián)研究表明CARM1的功能性多態(tài)rs117569851-通過調(diào)控Hcy代謝，可能參與冠心病的發(fā)生。
　　 第二部分 LPL基因多態(tài)位點rs1059611影響轉(zhuǎn)錄活性的初步研究
　　 目的:
　　 GWAS表明位于脂蛋白脂肪酶

11、(lipoprotein lipase，LPL)3'-UTR的多態(tài)位點rs1059611與血脂水平關(guān)聯(lián)，但其是否具有生物學(xué)功能尚不清楚。本研究初步探索該位點對轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄因子親和力的影響。
　　 方法:
　　 1)在pGL-3 promoter載體的報告基因下游插入含有rs1059611(C/T)位點的基因組序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒;利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，檢測該位點對轉(zhuǎn)錄活性的影響;
　　 2)提取人內(nèi)臟脂肪組

12、織核蛋白，與含有rs1059611(C/T)位點的探針孵育后進行電泳遷移率變更實驗(EMSA)，比較兩個等位基因與核蛋白結(jié)合形成的遷移帶的差異;分別用C等位基因和T等位基因的冷競爭探針與核蛋白預(yù)孵育，再加入生物素標(biāo)記的探針進行冷競爭EMSA實驗，觀察遷移帶是否消失。
　　 結(jié)果:
　　 1)含有rs1059611位點的序列能夠增強轉(zhuǎn)錄活性，常見等位基因T轉(zhuǎn)換為少見等位基因C后轉(zhuǎn)錄活性顯著增高(0.69 vs1.00);2