抗豬瘟病毒干擾素刺激基因的篩選及GBP1抗病毒分子機(jī)制的研究.pdf

1、病毒感染和宿主抗病毒是一個(gè)博弈的過(guò)程：許多病毒感染宿主后，病毒的病原相關(guān)分子模式被宿主的模式識(shí)別受體所識(shí)別，從而激活宿主 I型干擾素（IFN）信號(hào)通路，導(dǎo)致數(shù)以百計(jì)的干擾素刺激基因（ISGs）轉(zhuǎn)錄，為機(jī)體提供抗病毒防御；與此同時(shí)，病毒也進(jìn)化出多種高效的逃逸策略來(lái)抵抗宿主合成IFN、信號(hào)傳導(dǎo)以及ISGs的抗病毒功能。ISGs作為重要的抗病毒效應(yīng)分子，其在宿主防御和清除外源病原感染方面發(fā)揮重要作用。因此，研究抗病毒ISGs對(duì)于控制和治療病毒

2、感染具有重要意義。
　　豬瘟（CSF）是一種急性、烈性傳染病，在多個(gè)國(guó)家流行，給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬瘟病毒（CSFV）是CSF的病原，其屬于黃病毒科瘟病毒屬成員。CSFV感染宿主后，可激活I(lǐng)型IFN信號(hào)通路，產(chǎn)生抗病毒ISGs。與黃病毒科其它成員的抗病毒ISGs研究相比較，抗CSFV特異性ISGs研究報(bào)道很少，特別是ISGs抗CSFV感染的分子機(jī)制研究尚屬空白。研究抗CSFV ISGs不僅有助于深入了解宿主抗病

3、毒機(jī)理，同時(shí)也為揭示CSFV逃避宿主抗病毒策略提供線索。因此，研究抗CSFV ISGs既具有理論意義又具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究中，我們構(gòu)建了20種慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)豬源ISGs的PK-15細(xì)胞系。利用過(guò)表達(dá)細(xì)胞系結(jié)合表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶的報(bào)告豬瘟病毒（rCSFV-Fluc）篩選抗CSFV的ISGs，成功地篩選到6個(gè)ISGs顯著地抑制rCSFV-Fluc復(fù)制，分別是GBP1、GBP2、CD47、ZNF313、OASL和OAS1

4、。將篩選到的過(guò)表達(dá)GBP1、CD47、ZNF313和OASL細(xì)胞系感染親本病毒CSFV Shimen株，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)這些分子可以抑制親本病毒復(fù)制，說(shuō)明這4個(gè)ISGs分子是抗CSFV的ISGs。我們優(yōu)先選取鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白1（GBP1）進(jìn)行深入研究。研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)GBP1抑制CSFV復(fù)制，相反利用針對(duì)GBP1的小干擾RNA沉默內(nèi)源性的GBP1可以促進(jìn)CSFV復(fù)制。此外，GBP1發(fā)揮抗CSFV作用主要發(fā)生在病毒復(fù)制早期，及劑量依賴(lài)性

5、的抑制CSFV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的翻譯效率。CSFV感染豬或PK-15細(xì)胞后，可以引起GBP1在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá)。在GBP1抗CSFV分子機(jī)制方面，研究證實(shí)GBP1不能激活I(lǐng)FN-β和NF-κB信號(hào)通路，其抗CSFV是依賴(lài)于自身的GTPase活性。CSFV面對(duì)宿主GBP1的抗病毒效應(yīng)，其利用自身合成的NS5A蛋白與GBP1相互作用，通過(guò)抑制GBP1的GTPase活性進(jìn)而拮抗GBP1的抗CSFV活性。有趣的是，我們的研究還發(fā)現(xiàn)

6、，GBP1(K51A)突變體喪失了GTPase活性，且不能抑制CSFV復(fù)制。免疫共沉淀試驗(yàn)和GST pulldown試驗(yàn)結(jié)果表明，GBP1 N端的GTPase結(jié)構(gòu)域和NS5A的C端功能區(qū)是GBP1?NS5A相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。
　　總之，本研究利用報(bào)告病毒并結(jié)合過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的高通量篩選策略，獲得了6個(gè)抗CSFV ISGs候選分子。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的鑒定，證實(shí)GBP1為抗CSFV的ISG，并闡明了該分子發(fā)揮抗病毒作用依賴(lài)于其自身的GTPas