α7nAChR的克隆、表達(dá)及在Alzheimer病發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、該課題的目的在于建立表達(dá)α7的分子生物學(xué)方法,通過(guò)研究α7和Aβ<,1-42>在體內(nèi)和體外的關(guān)系,初步探討α7在Alzheimer病發(fā)病機(jī)制中的作用;尋找反映AD患者α7變化的指標(biāo),為AD的實(shí)驗(yàn)室檢查提供一種新的手段.第一部分應(yīng)用PCR方法,以胎腦cDNA為模板,擴(kuò)增出編碼α7的全長(zhǎng)cDNA序列,經(jīng)克隆、測(cè)序鑒定后,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pNASS-CMV-α7Neo和體外合成質(zhì)粒5'-UTR-α7-pSP64polyA,在H4細(xì)胞中表達(dá)α7

2、并在體外合成有活性的α7,在此基礎(chǔ)上,在細(xì)胞水平和蛋白質(zhì)水平觀察α7和Aβ<,1-42>的結(jié)合.結(jié)果顯示:體外合成的活性α7在一定條件下能與Aβ<,1-42>進(jìn)行牢固的結(jié)合;α7在H4細(xì)胞中有高效、穩(wěn)定的表達(dá),但表達(dá)部位主要在細(xì)胞內(nèi),不適合進(jìn)一步的功能研究;在克隆過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)除α7外,尚存在α7的兩種可變剪接(外顯子4缺失和外顯子4、5缺失兩種).第二部分應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,觀察α7在3例臨床和病理證實(shí)的AD患者腦中的表達(dá)及與Aβ

3、<,1-42>的關(guān)系.抗α7的抗Aβ<,1-42>分別染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):AD腦中有α7的異常沉積,其沉積部位與Aβ<,1-42>形成的老年斑的沉積部位一致,主要發(fā)生在海馬和顳葉皮層,絕大部分在細(xì)胞外,偶爾在細(xì)胞內(nèi),其沉積方式從形態(tài)看主要存在于老年斑中.抗α7和抗Aβ<,1-42>共同染色進(jìn)一步顯示:α7和Aβ<,1-42>共同沉積于AD腦的老年斑中.根據(jù)第一部分和第二部分研究,我們可以得出以下結(jié)論:α7和Aβ<,1-42>不僅能在體外緊密結(jié)

4、合,還能在AD患者腦中結(jié)合.我們推測(cè),α7和Aβ<,1-42>的結(jié)合可能使受體遭受破壞或阻滯,也可能造成α7介導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元的死亡,從而影響認(rèn)知和記憶.因此,α7在AD的發(fā)病機(jī)制中起到相當(dāng)關(guān)鍵的作用.第三部分應(yīng)用半定量RT-PCR方法,檢測(cè)30例AD患者和27例對(duì)照組老年人周?chē)?和duplicate α7(α7另一家族成員)mRNA的表達(dá)水平.結(jié)果發(fā)現(xiàn):在我們的實(shí)驗(yàn)條件下,不能測(cè)出周?chē)?mRNA的表達(dá),但能測(cè)出其外顯子4缺失的