α-,7--nAChR在星形膠質(zhì)細胞的表達及其在削弱Aβ介導(dǎo)的炎性因子分泌中的作用研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease AD)是一種慢性、進行性、神經(jīng)退行性疾病，以顱內(nèi)β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑形成為主要病理特征，表現(xiàn)為大腦皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元進行性退變、認(rèn)知功能下降。目前對AD的形成和發(fā)病機制的認(rèn)識主要集中于遺傳和環(huán)境因素所引起的腦內(nèi)慢性炎癥和膽堿能系統(tǒng)功能進行性下降，但具體環(huán)節(jié)還不清楚，因此，對AD的治療存在極大困難。 AD

2、的發(fā)生、發(fā)展與中樞炎癥有關(guān)。炎癥是Aβ沉積引起的繼發(fā)性反應(yīng)，也是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變的重要因素。參與炎性反應(yīng)的細胞主要有星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。這些細胞激活后可釋放多種細胞因子、趨化因子、補體及其激活物，導(dǎo)致非特異性炎細胞浸潤，產(chǎn)生慢性炎癥，使神經(jīng)系統(tǒng)受損。Aβ形成后既可對神經(jīng)細胞產(chǎn)生直接毒性作用，又可通過激活神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞釋放炎性介質(zhì)，觸發(fā)神經(jīng)細胞損傷的信號通路，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。 增加顱內(nèi)膽堿能

3、水平和N型乙酰膽堿受體激動劑對AD有一定療效，但作用機理尚不清楚。有證據(jù)顯示外周迷走神經(jīng)受刺激后釋放的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)與巨噬細胞a7-nAChR受體作用，可以抑制巨噬細胞炎性介質(zhì)的合成與分泌，削弱外周炎性反應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)雖然沒有外周巨噬細胞，但有大量的星形膠質(zhì)細胞和與外周巨噬細胞相似功能的小膠質(zhì)細胞參與Aβ介導(dǎo)的中樞炎性反應(yīng)，那么，星形膠質(zhì)細胞是否也具有α<,7>-nAChR以及激活星形膠質(zhì)細胞α<,7>-nAChR能否削弱Aβ介導(dǎo)的

4、中樞炎性反應(yīng)便值得關(guān)注。據(jù)此，本研究采用細胞培養(yǎng)，通過細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，首先明確α<,7>-nAChR在大鼠海馬和星形膠質(zhì)細胞的表達，然后觀察Aβ介導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細胞炎性介質(zhì)的表達與分泌，并通過α<,7>-nAChR激動劑，探討海馬星型膠質(zhì)細胞α<,7>-nAChR激活在Aβ引起的炎性反應(yīng)中的作用。 方法： 1．海馬腦片培養(yǎng)取出生10 d的SD大鼠海馬進行切片，將經(jīng)過漂洗后海馬腦片置于膜插件上進行液氣交界培養(yǎng)

5、。前3天培養(yǎng)條件為5％C02、37℃，每天換液1次，而后每3天換液1次，溫度降至33℃。 2．海馬星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)取新生SD大鼠，消毒后，采用無菌方法迅速取出大腦，分離海馬，經(jīng)胰蛋白酶消化后離心，棄上清再制成細胞懸液，接種至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待混合培養(yǎng)細胞生長至8-10天，收集貼壁細胞進行繼續(xù)培養(yǎng)，并通過星形膠質(zhì)細胞特異性抗體檢測GFAP的表達，以鑒定星形膠質(zhì)細胞的純度。 3．α<,7>-nAChR在體內(nèi)、體外海馬星形膠

6、質(zhì)細胞上的表達從大鼠腦中分離海馬后進行冰凍切片，采用免疫熒光雙染技術(shù)，首先用-GFAP抗體對星形膠質(zhì)細胞進行鑒定，再觀察α<,7>-nAChR在星形膠質(zhì)細胞上的表達。體外表達的研究在培養(yǎng)的海馬腦片和星形膠質(zhì)細胞上進行，分別采用免疫組化，免疫細胞化學(xué)，熒光雙染技術(shù)，用配體結(jié)合實驗和細胞免疫熒光雙標(biāo)，分析α<,7>-nAChR在星形膠質(zhì)細胞上的表達。 4．星形膠質(zhì)細胞α<,7>-nAChR激活對炎性介質(zhì)分泌的影響分離并培養(yǎng)星形膠質(zhì)細

7、胞，并分別收集激活與未激活α<,7>-nAChR的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液，采用液相芯片技術(shù)，檢測上清中白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、巨噬細胞炎性蛋白-1、RANTES的變化，明確膠質(zhì)細胞α<,7>-nAChR在削弱Aβ所致炎性反應(yīng)中的作用。 結(jié)果： 1．海馬腦片培養(yǎng)：培養(yǎng)海馬腦片，最初結(jié)構(gòu)較模糊，隨著培養(yǎng)時間延長，腦片明顯變薄，結(jié)構(gòu)逐漸清楚。10 d后海馬結(jié)構(gòu)更為明顯，此時用MTT染色法鑒定培養(yǎng)海馬腦片活

8、力，發(fā)現(xiàn)幾乎所有海馬腦區(qū)均顯蘭紫色，說明海馬腦片培養(yǎng)成活。 2．星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)與鑒定：原代培養(yǎng)細胞主要是以星形膠質(zhì)細胞為主，并含有小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞和少量的少突膠質(zhì)細胞。傳代培養(yǎng)后，神經(jīng)元消失。通過振搖獲得純化的星形膠質(zhì)細胞，在顯微鏡下呈單層生長，互不重疊，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞體粗大，胞突較豐富，多分支，以特異性抗-GFAP抗體為探針進行熒光細胞免疫鑒定，呈陽性。 3．α<,7>-nAChR在星形膠質(zhì)細胞的表達：海馬

9、組織中抗-GFAP染色陽性的細胞抗-α<,7>-nAChR染色也呈陽性，但僅部分抗-α<,7>-nAChR染色陽性的細胞抗-GFAP染色也呈陽性。體外單細胞培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞既能與FITC標(biāo)記的α-BTX結(jié)合，熒光染色呈陽性，同時，細胞免疫熒光雙標(biāo)分析顯示星形膠質(zhì)細胞抗-GFAP和抗-α<,7>-nAChR染色均呈陽性。 4． Aβ與星形膠質(zhì)細胞炎性因子的分泌：在培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞中加入200nmol/Lβ后，IL-1α、IL-1β

10、、IL-6、TNF-α和MIP-1、RANTES含量變化各不相同，其中Aβ對IL-1α的表達無明顯影響；對IL-1β的影響表現(xiàn)在Aβ 作用48 h之后，當(dāng)作用至72 h和96 h時，IL-1β分別增加至原來的2.1倍和6.3倍；IL-6與IL-1β變化相似，作用至72 h和96 h時，分別增加至原來的2.1倍和8倍；TNF-α在Aβ作用48 h前變化均較小，作用96 h增加至原來的4.7倍；而趨化因子MIP-1變化最為明顯，從A

11、β作用8 h就開始升高，隨著作用時間延長，呈時間依賴性增加，當(dāng)作用96 h時，可增加至原來的12倍；雖然RANTES也是趨化因子，其變化量不如MIP-1，Aβ作用96 h僅能使其增加4.8倍。5．α<,7>-nAChR激活對Aβ介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞炎性因子分泌的影響：用煙堿預(yù)激活膠質(zhì)細胞α<,7>-nAChR可以明顯削弱Aβ介導(dǎo)的膠質(zhì)細胞炎性介質(zhì)(除IL-1α外)的分泌，其中IL-1β、IL-6、TNF-α和MIP-1、RANTES分別由原