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1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文GAPDH過表達及異常聚集在帕金森病發(fā)病機制中作用的研究姓名:黃金莎申請學(xué)位級別:博士專業(yè):神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師:王濤20090515華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)果結(jié)果激光共聚焦結(jié)果顯示,正常細胞內(nèi)GAPDH蛋白均勻分布于胞漿,在細胞核內(nèi)僅有少量分布。魚藤酮處理后,胞漿內(nèi)GAPDH染色增強,且出現(xiàn)明顯的GAPDH染色陽性的聚集顆粒,部分細胞胞核內(nèi)也出現(xiàn)GAPDH的團塊狀聚集。非還原型SDSPAG
2、E顯示魚藤酮處理可時間依賴性的增加細胞內(nèi)二硫化鍵連接的GAPDH。隨魚藤酮處理時間的延長,細胞內(nèi)的GAPDH去垢劑可溶及去垢劑不溶的GAPDH均增多,提示細胞內(nèi)GAPDH可能出現(xiàn)了可溶性質(zhì)的改變并進一步產(chǎn)生聚集。結(jié)論結(jié)論魚藤酮可以導(dǎo)致細胞內(nèi)GAPDH的顆粒狀聚集。其聚集的可能原因是分子間二硫鍵的相互連接形成多聚體,并進一步聚集形成去垢劑難溶的蛋白。這可能是魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及包涵體形成的重要機制?!娟P(guān)鍵詞】帕金森病;魚藤酮;3磷酸甘
3、油醛脫氫酶;蛋白聚集第二部分第二部分干擾干擾GAPDH的過表達對多巴胺能神經(jīng)元的影響及作用機制的過表達對多巴胺能神經(jīng)元的影響及作用機制目的目的研究RNA干擾(RNAi)技術(shù)能否有效抑制GAPDH的表達以及對魚藤酮誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響及機制。方法方法在實驗過程中均添加1mM的丙酮酸以代償干擾引起的GAPDH糖酵解酶活性的改變。使用脂質(zhì)體lipofectamine2000將體外化學(xué)合成的針對GAPDH基因的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染進入
4、細胞,使用FAM標(biāo)記的siRNA進行轉(zhuǎn)染效率的檢測,通過實時熒光定量PCR(realtimePCR)和蛋白免疫印跡分析(Westernblot)進行干擾效果的鑒定;使用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察干擾對魚藤酮誘導(dǎo)的GAPDH定位和性狀的影響;羅丹明123染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化,AnnexinV及PI雙染檢測細胞凋亡比率。結(jié)果結(jié)果實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡分析顯示,化學(xué)合成的siRNA可有效抑制細胞內(nèi)GAPDHmRNA和蛋
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