CCL2在帕金森病輕度認(rèn)知功能障礙中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一章 CCL2在慢性小鼠帕金森病模型中血腦屏障的破壞及神經(jīng)炎癥中的作用研究
　　目的:構(gòu)建C57BL/6小鼠慢性帕金森病模型，觀察小鼠認(rèn)知功能狀況;研究CCL2在PD血腦屏障破壞中的作用，以及Bindarit對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用;并進(jìn)一步研究CCL2在顱內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)及多巴胺能神經(jīng)元變性丟失中的作用。
　　方法:33只雄性8周齡C57BL/6隨機(jī)分為3組，其中生理鹽水Con

2、trol組10只，MPTP/P模型組10只，Bindarit治療組13只。MPTP/P模型組給予25mg/kg MPTP、250mg/kg丙磺舒腹腔注射;Bindarit治療組給予25mg/kg MPTP、250mg/kg丙磺舒、100mg/kgBindarit腹腔注射;生理鹽水Control組給予等量生理鹽水注射，每周注射2次，連續(xù)注射5周。
　　結(jié)果:(1)爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠從桿頂下降到底部時(shí)間較Contr

3、ol組延長(zhǎng)（P＜0.05）;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Control組相比，MPTP/P模型組小鼠運(yùn)動(dòng)距離減少、運(yùn)動(dòng)速度下降、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間減少（P＜0.05）;水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠的逃避潛伏期較Control組有明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。(2)伊文思藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPTP/P模型組的伊文思藍(lán)滲出量比Control組顯著增多（P＜0.05）;Western blot結(jié)果顯示MPTP/P組小鼠腦組織中血腦屏障緊密連接

4、蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)量較Control組減少(P＜0.05)，透射電鏡結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠腦微血管內(nèi)膜有斷裂現(xiàn)象，血管周?chē)鷿B出增多，緊密連接破壞。(3) OX42免疫組化結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠腦組織中OX42陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較Control組增加。(4) TH免疫組化結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較Control組減少（P＜0.05）。(5)Western blot結(jié)果顯示

5、MPTP/P組小鼠腦組織中α-synuclein蛋白和caspase-3蛋白表達(dá)量較對(duì)照組增加(P＜0.05)。(6) TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡較Control組增加。(7)液相芯片結(jié)果顯示MPTP/P模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ、 CCL2含量高于對(duì)照組（P＜0.05）;而B(niǎo)indarit治療組則上述現(xiàn)象均有所改善。
　　結(jié)論:(1)C57BL/6小鼠腹腔注射

6、MPTP、丙磺舒，每周注射2次，連續(xù)注射5周，可以制作穩(wěn)定的慢性PD模型，且部分小鼠存在認(rèn)知功能障礙。(2)CCL2在慢性PD小鼠模型中可能起到破壞血腦屏障，促進(jìn)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化、炎癥產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡的作用。(3)Bindarit在慢性PD小鼠模型中可能起到一定的治療作用。
　　第二章 CCL2促進(jìn)α-Synuclein介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化及神經(jīng)元凋亡
　　目的:通過(guò)原代小膠質(zhì)細(xì)胞、原代神經(jīng)元培養(yǎng)，

7、探索CCL2是否促進(jìn)α-Synuclein(α-Syn)介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，導(dǎo)致氧自由基、炎性因子產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加。
　　方法:原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化后分為6組:分組方法①0ng/ml組、12.5ng/ml組、25ng/ml組、50ng/ml組、100ng/ml組、200ng/ml組，分別給予相應(yīng)劑量的CCL2處理;分組方法②Control組、CCL2組、α-Syn組、CCL2+α-Syn組、CCL2+α-

8、Syn+CCL2 Ab組、CCL2+α-Syn+BIND組，其中CCL2組:50ng/mlCCL2;α-Syn組:200ng/mlα-Syn; CCL2+α-Syn組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn;CCL2+α-Syn+CCL2 Ab組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+5ug/mlCCL2 Ab;CCL2+α-Syn+BIND組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+50nMBin

9、darit。處理24小時(shí)后:(1) CCK8法、Brdu法檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化情況;(2) Griess試劑檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量;(3) ELISA法檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β含量;(4)免疫熒光檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞α-Syn表達(dá)情況;(5)原代神經(jīng)元培養(yǎng)，加入各組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，流式細(xì)胞法檢測(cè)其對(duì)神經(jīng)元凋亡的作用。
　　結(jié)果:(1) CCK8法、Brdu法檢測(cè)各劑量CCL2組小膠質(zhì)細(xì)胞增

10、殖活化情況，結(jié)果顯示50ng/ml組小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化最為明顯，其次為100ng/ml組，這兩組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化最為明顯，其次為CCL2組，這兩組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CCL2+α-Syn+CCL2 Ab組和CCL2+α-Syn+BIND組增殖活化細(xì)胞相對(duì)減少。(2) Griess試劑檢測(cè)各劑量CCL2組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO

11、含量，結(jié)果顯示顯示50ng/ml組小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO含量最多，其次為100ng/ml組，這兩組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO量最多，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，加入CCL2 Ab或者Bindarit后，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO含量相對(duì)減少。(3) ELISA法檢測(cè)各劑量CCL2組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α及IL-1β含量，結(jié)果顯示各組與對(duì)照組相比差異沒(méi)

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及IL-1β含量最多，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），加入CCL2 Ab或者Bindarit后，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及IL-1β含量相對(duì)減少。(4)免疫熒光法檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞α-Syn表達(dá)情況。結(jié)果顯示CCL2+α-Syn組小膠質(zhì)細(xì)胞α-Syn表達(dá)最多，加入CCL2 Ab或者Bindarit組，小膠質(zhì)細(xì)胞α-Syn表達(dá)減少。(

13、5)流式檢測(cè)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元各組凋亡情況，結(jié)果顯示加入CCL2+α-Syn組培養(yǎng)液的神經(jīng)元凋亡比率最高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，加入CCL2 Ab或者Bindarit組，神經(jīng)元凋亡相對(duì)減少。
　　結(jié)論:CCL2能促進(jìn)α-Syn介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，導(dǎo)致NO等氧自由基、炎性因子如TNF-α及IL-1β等產(chǎn)生增加，進(jìn)而引起神經(jīng)元凋亡增加。
　　第三章 CCL2基因多態(tài)性及其血漿、腦脊液水平與帕金森病認(rèn)知

14、功能障礙關(guān)系研究
　　目的:(1)探討廣東省漢族人群中CCL2啟動(dòng)子區(qū)2518A/G(rs1064211)及其受體趨化因子受體2(CCR2) V64I(rs1799864)基因多態(tài)性與PD及PD認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。(2)對(duì)PD及PD-MCI患者的血漿、腦脊液CCL2水平進(jìn)行檢測(cè)，探討血漿、腦脊液CCL2水平與PD、PD-MCI的關(guān)系。
　　方法:(1)收集521例PD患者及556例正常對(duì)照者全血，采用連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR

15、)法檢測(cè)兩組患者CCL22518A/G(rs1064211)及CCR2 V64I(rs1799864)基因多態(tài)性。其中217例PD患者采用簡(jiǎn)易認(rèn)知功能評(píng)估量表(MMSE)、蒙特利爾評(píng)估量表(MOCA)、成人韋氏認(rèn)知功能評(píng)估量表(WAIS-RC)、成人韋氏記憶力評(píng)估量表(WMS-RC)評(píng)估其認(rèn)知功能。運(yùn)用R×C卡方檢驗(yàn)比較兩組基因型分布頻率的差異，方差分析比較PD患者各基因型認(rèn)知障礙的差異，分析其與PD及PD認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。(2)收

16、集140例PD患者和70例正常對(duì)照者血漿，45例PD患者和16例正常對(duì)照者腦脊液，再將PD組分為PDCN組和PD-MCI組;采用ELISA法檢測(cè)血漿、腦脊液中CCL2水平，比較PDCN組、PD-MCI組和對(duì)照組血漿、腦脊液CCL2濃度水平。
　　結(jié)果:(1)PD組及正常對(duì)照組CCL2及CCR2等位基因和基因型頻率之間不存在差異（P＞0.05）。同時(shí)，PD患者中CCL2及CCR2各基因型之間未發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙差異（P＞0.05）。(2)

17、 PDCN組和PD-MCI組的血漿CCL2濃度明顯高于正常對(duì)照組，且PD-MCI組更高(P＜0.05)。PD-MCI組的腦脊液CCL2濃度相對(duì)正常對(duì)照組及PDCN組明顯增高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:(1)在廣東漢族人群中CCL2-2518A/G(rs1064211)及CCR2 V64I(rs1799864)基因多態(tài)性與PD及PD認(rèn)知障礙可能無(wú)相關(guān)性。(2) PD患者血漿CCL2水平高于正常對(duì)照組，并且PD-MCI組尤為顯著。(