GIGYF2在糖尿病腦病小鼠認(rèn)知功能障礙中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病長(zhǎng)期糖代謝紊亂可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，腦信號(hào)傳導(dǎo)異常，神經(jīng)傳遞及突觸可塑性減弱等病理?yè)p害，統(tǒng)稱(chēng)為糖尿病腦病。目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，缺乏有效的防治手段。近年來(lái)多項(xiàng)證據(jù)表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)信號(hào)通路障礙與糖尿病的認(rèn)知功能障礙發(fā)病密切相關(guān)。研究表明，生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白10(Grb10)可負(fù)性調(diào)節(jié)IGF1R通路，持續(xù)高血糖可導(dǎo)致糖尿病大鼠海馬組織中Grb10的過(guò)表達(dá)，繼而導(dǎo)致

2、大鼠認(rèn)知功能障礙等行為學(xué)改變。Grb10 GYF相互作用蛋白2(Grb10 Interacting GYFProtein2,GIGYF2)作為與Grb10分子N末端特異性結(jié)合的蛋白，兩者存在一定的協(xié)同作用。已有研究證實(shí)，GIGYF2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，且GIGYF2表達(dá)水平的變化可影響IGF1R運(yùn)輸，并激活I(lǐng)GF1引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)GIGYF2的研究多集中在基因水平，并證實(shí)其基因突變與家族遺傳性帕金森病的發(fā)病相

3、關(guān)。然而，內(nèi)源性GIGYF2在糖尿病腦病中研究鮮有報(bào)道。
　　目的：
　　本研究旨在觀察GIGYF2基因在糖尿病腦病小鼠海馬組織中的表達(dá)，及其行為學(xué)和海馬組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變;并觀察特異性下調(diào)海馬組織GIGYF2基因表達(dá)，對(duì)Grb10和IGF1R基因表達(dá)的影響，對(duì)糖尿病腦病小鼠行為學(xué)和組織病理及超微結(jié)構(gòu)的影響，從而探討內(nèi)源性GIGYF2在糖尿病腦病中的主要作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　糖尿病小鼠模型由單次

4、腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)（溶于0.1M檸檬酸鈉溶液PH4.5，180mg/Kg）誘導(dǎo)建立。72小時(shí)后取鼠尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖，將血糖值達(dá)到或超過(guò)16.7mol/L者確定為糖尿病小鼠，血糖值未達(dá)標(biāo)者予以剔除。以機(jī)體長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)，誘發(fā)糖尿病小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥。為進(jìn)一步研究GIGYF2的功能，在糖尿病小鼠血糖穩(wěn)定后，我們通過(guò)立體定位技術(shù)將攜帶GIGYF2-shRNA的慢病毒顆粒定點(diǎn)注射入海馬組織，早期組織特異性的干預(yù)GIGYF2基

5、因的表達(dá)。糖尿病小鼠隨機(jī)分為三組:糖尿病(DM)組，糖尿病假干預(yù)(DM+0)組和糖尿病干預(yù)（DM+ shRNA）組，正常小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(Con)組和正常干預(yù)(Con+ shRNA)組，每組12只小鼠。高血糖持續(xù)十周后，我們行水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的認(rèn)知功能，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組小鼠GIGYF2，Grb10和IGF1R的表達(dá)水平，并通過(guò)光鏡和電鏡觀察海馬組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.腹腔

6、注射STZ誘導(dǎo)小鼠血糖水平明顯升高(P＜0.05)，而體重明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，成功建立糖尿病小鼠模型。
　　2.高血糖持續(xù)十周后行水迷宮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示糖尿病腦病小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，穿越站臺(tái)次數(shù)和目的象限內(nèi)時(shí)間的明顯減少(P＜0.01)，小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能受損，誘發(fā)認(rèn)知功能障礙，形成糖尿病腦病;敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達(dá)后，小鼠的逃避潛伏期、穿越站臺(tái)次數(shù)和目的象限內(nèi)時(shí)間的變化不明顯，

7、與正常對(duì)照組的結(jié)果類(lèi)似，而與糖尿病組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，
　　3.糖尿病腦病小鼠海馬組織中GIGYF2和Grb10基因均較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05或＜0.01），呈過(guò)表達(dá)，而IGF1R的表達(dá)水平卻明顯降低(P＜0.05)，且海馬組織中GIGYF2的表達(dá)水平與糖尿病腦病小鼠的認(rèn)知功能水平相關(guān)。腦內(nèi)定點(diǎn)注射GIGYF2-shRNA慢病毒顆?？砷L(zhǎng)期穩(wěn)定下調(diào)糖尿病腦病小鼠海馬區(qū)GIGYF2基因的表達(dá)(P＜0.05

8、)，而對(duì)糖尿病小鼠Grb10的過(guò)表達(dá)和IGF1R的低表達(dá)無(wú)明顯影響，但I(xiàn)GF1R磷酸化水平明顯升高，恢復(fù)至正常水平(P＜0.05);
　　4.持續(xù)高血糖可導(dǎo)致糖尿病腦病小鼠海馬組織一系列病理生理變化:病理HE染色結(jié)果顯示，糖尿病小鼠海馬椎體細(xì)胞層排列紊亂，神經(jīng)元凋亡明顯，神經(jīng)膠質(zhì)大量增生;海馬CA1區(qū)電鏡結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)元腫脹，突觸小體的形態(tài)異常，突觸小體明顯減少。而海馬內(nèi)敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達(dá)，可明顯減少糖尿

9、病小鼠海馬組織神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)纖維纏結(jié)，減輕突觸小體形態(tài)和數(shù)量等超微結(jié)構(gòu)的改變，保持良好的突觸功能，與正常小鼠海馬組織結(jié)構(gòu)類(lèi)似。
　　結(jié)論：
　　1.腹腔注射STZ可成功建立糖尿病小鼠模型，長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致小鼠行為學(xué)改變，誘發(fā)認(rèn)知功能障礙，形成糖尿病腦病。
　　2.持續(xù)高血糖狀態(tài)可造成海馬組織GIGYF2的過(guò)表達(dá)和小鼠認(rèn)知功能障礙。腦內(nèi)定點(diǎn)注射GIGYF2-shRNA慢病毒顆粒可長(zhǎng)期穩(wěn)定下調(diào)海馬區(qū)該基因的表達(dá)水平，改

10、善糖尿病小鼠的認(rèn)知功能障礙，表明糖尿病腦病小鼠的認(rèn)知功能水平與海馬組織中GIGYF2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　3.糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2表達(dá)接近正常水平時(shí)，對(duì)糖尿病腦病小鼠Grb10的過(guò)表達(dá)和IGF1R的低表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響，而IGF1R磷酸化則恢復(fù)至正常水平，由此可活化IGF1R-Grb10信號(hào)通路。
　　4.糖尿病腦病小鼠海馬組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)可有明顯的神經(jīng)元退行性變的表現(xiàn)，為小鼠認(rèn)知功能障礙提供了組織學(xué)證據(jù)。

11、敲低糖尿病小鼠海馬組織GIGYF2的表達(dá)，可明顯改善海馬組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　綜上所述，糖尿病腦病中，內(nèi)源性過(guò)表達(dá)的GIGYF2可通過(guò)綁定于Grb10分子的N末端與IGF1R間接結(jié)合，引起IGF1R磷酸化水平的變化，負(fù)性調(diào)節(jié)IGF1R及其下游信號(hào)通路，從而加劇糖尿病腦病的認(rèn)知功能障礙。敲低糖尿病腦病小鼠海馬組織GIGYF2表達(dá)可明顯改善糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙以及海馬組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化，表明海馬內(nèi)敲低糖尿病小鼠