骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中作用的研究

1、,,骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中作用的研究,作者：##,###########,,前言,材料和方法,結(jié)論,結(jié)果,,一 前言,二 材料與方法,三 結(jié)果,四 結(jié)論,,又稱為Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴細(xì)胞活化因子)，是一種多功能的胞外基質(zhì)蛋白，表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中；有兩種形式：分泌型骨橋蛋白( sOPN)和胞內(nèi)型骨橋蛋白 (iOPN)

2、；早期研究發(fā)現(xiàn)，OPN能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但在不同的環(huán)境中OPN的作用可能會表現(xiàn)出不同的側(cè)重。,骨橋蛋白(OPN),研究背景,累及全消化道的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾??；病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用；研究發(fā)現(xiàn)，OPN在炎癥性腸病患者發(fā)炎的腸道組織中的表達(dá)增加。,炎癥性腸?。↖BD）,ＯＰＮ對ＩＢＤ患者會產(chǎn)生何種影響？,問題,,一 前言,二 材料與方法,

3、三 結(jié)果,四 結(jié)論,,研究目的,,（1）采用 IBD 小鼠模型實(shí)驗(yàn)觀察 OPN 缺失對小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎的影響,（2）研究骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中的作用,,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,研究對象,臨床癥狀,臨床評分標(biāo)準(zhǔn),,,體重下降超過5%,脫肛,腹瀉,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,對IL-10 KO 和 OPN

4、/IL-10 DKO 小鼠的臨床癥狀表現(xiàn)進(jìn)行評分。出現(xiàn)該臨床癥狀計(jì)1分，否則為0。合計(jì)得出總分。,肛周粘液分泌物,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,患結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織切片微觀分析,基因表達(dá)定量分析,熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測分泌的磷蛋白1基因編碼區(qū)OPN,酶聯(lián)免疫吸附法量化上清液中TNF-α、IL-6、IL-12p40含量,小鼠腸粘膜固有層單個核細(xì)胞的分離,末端限制

5、性片段長度多態(tài)性分析,提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分析吞噬作用,腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類的鑒別,統(tǒng)計(jì)分析(非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗(yàn)或Bonferroni校正單向分析),8,7,6,5,4,3,2,1,9,10,小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞的準(zhǔn)備和刺激,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,1.提取mRNA（異硫氰酸胍-酚氯仿法）；2.進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（SuperScript II反

6、轉(zhuǎn)錄酶）；3.分析互補(bǔ)DNA對GAPDH，IL-6，IFN-γ，IL-17A和CD11bmRNA的表達(dá)（LightCycler 480 System II）；4.目的基因以GAPDH為參照標(biāo)準(zhǔn)。,基因表達(dá)定量分析,GAPDH 5’-CAA CTTTGT CAA GCT CAT TTC C-3’(正) 5’-GGT CCA GGG TTT CTT ACT CC-3’ (反)IL

7、-6 5’-AGT CCG GAG AGG AGA CTT CA-3’ (正) 5’-ATT TCC ACG ATT TCC CAGAG-3’ (反)IFN-γ 5’-AGC TCT TCC TCA TGG CTG TT-3’ (正) 5’-ATC TGGCTC TGC AGG ATT TT-3’

8、 (反)IL-17A 5’-TCT CTG ATG CTG TTG CTG CT-3’ (正) 5’-CGT GGA ACG GTT GAG GTA GT-3’ (反)CD11b 5’-GCT CCG GTA GCATCA ACA AC-3’ (正) 5’-AGT GAA TCC GGA ACT CGT

9、CCG-3’ (反),引物序列,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,1.小鼠股骨和脛骨骨髓中提取骨髓細(xì)胞；2.含10%熱滅活的胎牛血清，100mg/ml鏈霉素，100mg/ml 青霉素和40ng/ml重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子RPMI1640培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)5天；3.衍生的巨噬細(xì)胞按5×105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，經(jīng)10ng/ml IFN-

10、γ隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK4 50 -500 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ODN1585500 nM）刺激細(xì)胞24h；4.吸取上清液-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的準(zhǔn)備和刺激,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,1.小鼠結(jié)腸組織切片，PBS沖洗；2.含5 mM EDTA 和1 mM二硫蘇糖醇漢克平衡鹽緩沖液中去除上皮細(xì)胞；3.含0.

11、5 mg/ml 膠原酶D、0.5 mg/mlDNA酶I、3 mg/ml DispaseII PBS中用37℃搖床孵育30分鐘慢速旋轉(zhuǎn)，棄上清用40%的Percoll分離液重懸，80% Percoll分離液覆蓋；4.離心后即可在兩層Percoll液的界面上獲取LPMCs，PBS洗滌5.LPMCs中提取RNA,小鼠腸粘膜固有層單個核細(xì)胞的分離,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步

12、驟,1.小鼠盲腸置于含100 mM 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 9.0)、40 mM 乙二胺四乙酸、4 M 硫氰酸胍 0.001% 溴麝香草酚藍(lán)的溶液中，分解懸浮物中的糞便，提取糞便DNA；2.5’-FAM-labeled 516f 和1510r 作引物從糞便DNA中生成16 s rRNA擴(kuò)增子，10 U of Bsl l 處理3小時，ABI PRISM 3130xl基因分析儀進(jìn)行分餾；3.OTUs分析1–3 bp長度末端限制性片

13、段，得到T-RFLP文件，進(jìn)行主成分分析。,末端限制性片段長度多態(tài)性分析,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,1.小鼠腹腔注射3mL4%巰乙酸，第4天獲取腹膜滲出細(xì)胞。去除紅細(xì)胞，使用抗CD11b磁珠選擇CD11b陽性thioglycollate誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞(TEPMs)；2.TEPMs按2.5×105個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)含40 ng/ml重組巨

14、噬細(xì)胞集落刺激因子的RPMI 1640中隔夜孵化，PBS清洗，在這些孔中，分別增加重組OPN濃度1, 10, 100, 1000 ng/ml，細(xì)胞在37°C培養(yǎng)；3.在活細(xì)胞成像溶液中用熒光粒子稀釋,用熒光酶標(biāo)儀在指定時間測量熒光強(qiáng)度。4.所有實(shí)驗(yàn)孔中，通過減弱陰性對照孔平均熒光強(qiáng)度評估吞噬活性,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取和吞噬作用分析,,二 材料與方法,,一 前言,三 結(jié)果,四 結(jié)論,實(shí)驗(yàn)方法

15、與步驟,1.在無菌條件下獲得MLNs，提取細(xì)菌DNA；2.通用引物(27F； 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, 1492R；5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)擴(kuò)增細(xì)菌的16s rRNA，內(nèi)引物(35F；5’-CCT GGC TCA GGA TGA ACG-3’；519R；5’-ATT ACC GCG GCK GCT C-3’)擴(kuò)增巢式PCR；3. 1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增

16、產(chǎn)物，用QIAEX II凝膠萃取設(shè)備提純，綁定到PCR4-TOPO載體，使用TOPO-TA克隆工具將其轉(zhuǎn)變?yōu)镋. coli TOP10 細(xì)胞;4.TempliPhi系統(tǒng)擴(kuò)增16S rRNA基因，用作DNA測序模板。ABI 3730 DNA分析儀進(jìn)行分析，從日本DNA數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)所有條目，BLAST分析檢查所有的核苷酸序列，用DNA序列分析軟件進(jìn)行匹配。,腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類(MLNs)的鑒別,,三 結(jié)果,,二 材料與方法,

17、,一 前言,四 結(jié)論,OPN KO小鼠沒有出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎,OPN KO小鼠直腸組織HE-染色劑圖像,WT小鼠和IL-10 KO小鼠直腸組織OPN基因的表達(dá),IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠臨床得分隨時間的變化情況,,,,OPN缺失導(dǎo)致IL-10 KO小鼠結(jié)腸中合成OPN mRNA增多,OPN/IL-10 DKO小鼠表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀,,三 結(jié)果,二 材料與方法,,一 前言,四

18、 結(jié)論,IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO小鼠組織學(xué)得分變化情況（左）和4周齡直腸組織HE-染色劑圖像（右）,4周齡 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠結(jié)腸組織IL-6、IFN-γ和IL-17A基因表達(dá),,OPN/IL-10 DKO小鼠很快發(fā)生結(jié)腸炎，而在4周齡發(fā)生免疫細(xì)胞浸潤增多和顯著的直腸上皮增生,,OPN/IL-10 DKO小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)比IL-10 KO小鼠多,,三

19、 結(jié)果,,二 材料與方法,,一 前言,四 結(jié)論,4周齡的WT、IL-10 KO和 OPN/IL-10 DKO 小鼠直腸組織OPN mRNAFISH圖像,IL-10 KO小鼠直腸組織合成OPN mRNA更多,,4周齡IL-10 KO小鼠直腸組織OPN mRNA FISH圖像(紅) E-cadherin免疫熒光染色(綠),,IL-10 KO小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞OPN的合成增多,,三 結(jié)果,,二 材料與方法,

20、,一 前言,四 結(jié)論,3周齡IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠糞便樣本T-RFLP數(shù)據(jù),主要成分分析T-RFLP 數(shù)據(jù),IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠腸道細(xì)菌組成有明顯差異,OPN/IL-10 DKO小鼠有更低豐度的梭狀芽孢桿菌亞群XIVa和更高豐度的梭狀芽孢桿菌XVIII,,,,三 結(jié)果,,二 材料與方法,,一 前言,四 結(jié)論,IL-10KO

21、和 OPN/IL-10 DKO小鼠結(jié)腸組織CD11b 基因表達(dá),刺激物刺激WT、OPN KO、 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠產(chǎn)生BMDMs細(xì)胞因子數(shù)量,IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO 小鼠 LPMCs中NOS2, TNF-α, and IL-12p40基因的表達(dá),,OPN能影響巨噬細(xì)胞的活動,,三 結(jié)果,二 材料與方法,,一 前言,四 結(jié)論,WT、OPN KO、 IL-1

22、0 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠在E. Coli 熒光共軛粒子作用后 TEPMs 熒光強(qiáng)度的變化情況,OPN KO小鼠在E. Coli 熒光共軛粒子作用TEPMs熒光強(qiáng)度的變化情況,,OPN能影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能,,三 結(jié)果,二 材料與方法,,一 前言,四 結(jié)論,3周齡IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類,相比IL-10 KO小鼠，OPN/IL-10 DKO小鼠腸

23、系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類更多,,,,結(jié)論,四 結(jié)論,,三 結(jié)果,二 材料與方法,一 前言,OPN缺失會加快IBD小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎的發(fā)病。OPN的合成集中在結(jié)腸上皮細(xì)胞，并對炎癥信號迅速響應(yīng)。 OPN 缺失會影響體內(nèi)腸道菌群，sOPN和iOPN都能夠控制巨噬細(xì)胞吞噬功能。自發(fā)性結(jié)腸炎時OPN對腸道細(xì)菌的具體作用和對體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響有待進(jìn)一步研究，它會對OPN在結(jié)腸炎各階段作用和IBD的病理生理學(xué)研究提