防御素在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用及其分子機制研究.pdf

1、目的 炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制涉及遺傳、環(huán)境、免疫反應等，但真正的致病元兇尚不清楚。腸粘膜可直接產生免疫效應分子對抗腸腔內微生物，或通過信號傳導啟動粘膜獲得性免疫反應，介導直接的粘膜保護反應。防御素是一類非常重要的免疫效應分子。β防御素-2誘導性表達于上皮細胞，發(fā)揮抗微生物活性。本課題利用惡唑酮小鼠結腸炎模型研究結腸粘膜組織中β防御素-2與促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β的表達以及相互關系，探討β防御素-2表達的調控機

2、制，旨在探索結腸炎炎癥反應擴大的原因。 材料與方法 1．建立小鼠惡唑酮結腸炎模型，進行大體和組織病理學評價。2．免疫組化方法測定小鼠結腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1、pERK蛋白表達。3．熒光定量RT-PCR測定小鼠結腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-l β和NF-κ Bp65mRNA的表達。4．Western B1otting蛋白印跡測定小鼠結腸粘膜β防御素-2蛋白的表

3、達。5．ELISA測定兩組結腸粘膜組織上清液中TNF-α和IL-1 β的表達。6．細胞培養(yǎng)：Caco 2細胞株加LPS刺激，再與HBD2抗體共同孵育。實時熒光定量PCR檢測不同時段TNF-α和IL-1β的mRNA表達變化情況。 結果 1．小鼠惡唑酮結腸炎造模成功，小鼠結腸粘膜有肉眼和組織學炎癥。2．免疫組化檢測到β防御素-2在β組結腸粘膜表達顯著高于A組(p

4、達顯著高于A組(p

5、mRNA表達水平B組顯著高于A組，兩組比較有顯著性差異(p

6、組，兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。 結論 1．惡唑酮結腸炎小鼠結腸粘膜β防御素-2的表達顯著高于正常對照組。促炎因子TNF-α和IL-1β的表達顯著高于對照組，且與β防御素-2的表達呈平行關系。說明β防御素-2的表達與促炎因子的表達密切相關，兩者相加可能是結腸炎癥反應放大、持續(xù)遷延的原因之一。2．惡唑酮結腸炎小鼠結腸粘膜NF-kBp65、ERK-1、pERK表達顯著高于正常對照組，且與β防御素-2的表達呈正相關

7、，推測β防御素-2的誘導表達涉及NF-kB和MAPK等多條細胞內信號傳導通路。3．阻斷β防御素-2后，下調Caco2細胞株對TNF-α和IL-1βmRNA水平的表達，及其具有時效關系，提示HBD2可能促進TNF-α和IL-1β的分泌，在炎癥級聯(lián)反應中有重要作用。 目的 采用Oxazolone小鼠結腸炎模型進行研究，給予小鼠益生菌混合制劑VSL[＃]3干預，觀察對小鼠結腸炎的預防治療作用及其對β防御素-2、TNF-α、IL

8、-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達的影響，從分子水平探討腸道益生菌減輕炎癥反應的作用機制，為進一步臨床應用益生菌治療IBD奠定理論基礎。 材料與方法 1．建立小鼠惡唑酮結腸炎模型并分組：6-8周齡健康雌性Balb/c小鼠分兩組，即治療組和預防組。每組又分為三個亞組，即VSL[＃]3預防組、SASP預防組、預防對照組；VSL[＃]3治療組、SASP治療組、治療對照組。然后取結腸組織進行大體和組織病理學

9、評價VSL[＃]3的療效。2．免疫組化方法檢測各組結腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β的表達情況，以及NF-k Bp65、ERK-1和pERK的表達情況。3．RT-PCR技術檢測各組結腸組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-k Bp65mRNA 的表達情況。4．Western blot方法檢測各組小鼠結腸粘膜β防御素-2的蛋白表達情況。5．ELISA方法檢測各組小鼠結腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β

10、蛋白表達情況。 結果 1．VSL[＃]預防組和治療組小鼠結腸粘膜病變的大體和組織病理學評分顯著低于預防對照組和治療對照組(p<0.05)，與SASP預防組和治療組比較無顯著性差異(p>0.05)。2．免疫組化方法檢測VSL[＃]3預防組和VSL[＃]3治療組結腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β、的表達顯著低于預防對照組和治療對照組(p<0.05)，與SASP預防組和治療組比較沒有顯著性差異(p>0.05)

11、。VSL[＃]3預防組和治療組結腸粘膜組織中NF-K Bp65、ERK-1和pERK蛋白的表達與對照組比較顯著下調(p>0.05)。3．RT-PCR檢測VSL[＃]預防組和VSL[＃]治療組結腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β和NF-kBp65mRNA表達顯著低于預防對照組和治療對照組(p<0.05)，與SASP預防組和SASP治療組比較沒有顯著性差異(p>0.05)。4．Western blot方法檢測VSL[＃]3預防

12、組和治療組結腸粘膜β防御素-2的蛋白表達顯著低于預防對照組和治療對照組(p<0.05)。5．ELISA方法檢測VSL[＃]3預防組和治療組結腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β蛋白表達顯著低于預防對照組和治療對照組(p<0.05)。 結論 1．VSL[＃]3對惡唑酮誘導的小鼠結腸炎有預防作用和治療作用。2．VSL[＃]3預防治療惡唑酮誘導的小鼠結腸炎的機制可能與下調促炎因子和β防御素-2的表達有關。3．VSL[＃]

13、3下調促炎因子和β防御素-2的表達可能涉及NF-κB和MAPKs等多條細胞內信號傳導通路。 目的 本研究檢測人類潰瘍性結腸炎(UC)結腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-1 β在蛋白水平和轉錄水平的表達，探討防御素和細胞因子表達之間的關系，以及在UC發(fā)生發(fā)展中的作用。同時檢測了UC結腸粘膜中NF-κ Bp65的表達和MAPKs通路中ERK-1和pERK在結腸粘膜組織中的表達，旨在探討UC患者中HBD2激活的信號傳導通路，

14、以及在UC發(fā)病中的作用。 材料與方法 1．選擇2004.12～2005.12四川大學華西醫(yī)院消化科確診的UC患者，計算疾病活動度(LJCAI)，對UC進行病理學分級。2．免疫組化方法檢測UC和正常對照組結腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-l β的表達，以及NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達。3．實時熒光定量RT-PCR方法測定UC患者和正常對照組中HBD2、TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65 m

15、RNA在轉錄水平的表達。4．Western blot方法檢測UC患者和正常對照組結腸粘膜HBD2蛋白的表達。5．ELISA方法檢測UC患者和正常對照組結腸粘膜TNF-α、IL-1β蛋白的表達。 結果 1．35例UC患者中輕度10例，中度13例，重度12例。病理分級Ⅰ級11例，Ⅱ級13例，Ⅲ級11例。IJCA工評分與病理分級之間呈正相關(p<0.05)。2．免疫組化方法發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1β在UC結腸粘膜的

16、表達顯著高于對照組，陽性率隨病理學分級增高而逐漸增高(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)表達顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)；NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達在UC患者顯著高于正常對照組(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。HBD2與TNF-α、IL-1β、NF-κ Bp65、ERK-l和pERK的表達呈正相關。3．實時熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65

17、mRNA在UC結腸粘膜的表達顯著高于對照組，隨病理學分級增高逐漸增強(p<0.05)，炎癥粘膜區(qū)表達顯著高于非炎癥粘膜區(qū)，HBD2與TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65的表達間呈正相關。4．western blot證實UC結腸上皮HBD2的表達顯著高于正常對照組(p<0.05)，且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。5．ELISA檢測結果顯示UC結腸上皮TNF-α、IL-1 β蛋白表達顯著高于正常對照組(p<0.05

18、)，且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。 結論 1．UC結腸粘膜HBD2表達顯著高于正常對照組、炎癥粘膜部位顯著高于非炎癥粘膜部位，且與促炎因子TNF α和IL-β的表達呈正相關，提示HBD2和促炎因子互為因果、互相誘生，使炎癥反應不斷放大、使UC炎癥損傷不斷加重。2．UC結腸粘膜NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達顯著高于正常對照組，且與HBD2的表達呈正相關，提示HBD2在UC結腸粘膜中的上