α7nAChR功能狀態(tài)在調(diào)控肥胖時(shí)促酰化蛋白抵抗中的作用及具體機(jī)制.pdf

1、背景及目的
　　二十世紀(jì)90年代至今，科技的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，生產(chǎn)力得到極大的提高，生活方式的改變，肥胖發(fā)生率在全球范圍內(nèi)逐漸增高。肥胖以脂肪細(xì)胞體積增大、甘油三脂數(shù)量增多和慢性低度炎癥為特征，成為人類(lèi)的健康殺手。脂肪組織不僅以甘油三脂的形式儲(chǔ)存能量，而且和其他內(nèi)分泌器官一樣具有內(nèi)分泌功能，大量分泌促?；鞍祝╝cylation stimulating protein, ASP）、瘦素、脂聯(lián)素等，該類(lèi)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為脂肪因子。研究發(fā)

2、現(xiàn)，脂肪因子具有調(diào)節(jié)糖、脂代謝和胰島素的敏感性等功能,與機(jī)體胰島素抵抗、中心性肥胖等相關(guān)。促?；鞍祝ˋSP）是近來(lái)備受關(guān)注的脂肪因子，它是由補(bǔ)體C3和因子B、因子D作用，分裂成C3a，然后C3a分裂產(chǎn)生C3adesArg(即ASP)。C5L2是ASP的受體，表達(dá)于脂肪、肝臟、骨骼肌、腎臟等組織。在脂肪細(xì)胞，ASP直接與 C5L2結(jié)合,激活 PLCβ,促進(jìn)PKCα和PKCδ磷酸化蛋白的表達(dá)，提高DGAT的活性和促進(jìn)GLUT4易位,通過(guò)P

3、LC以及PI3K-AKT，參與促?；鞍捉閷?dǎo)的甘油三酯的合成。
　　肥胖時(shí)，脂肪細(xì)胞合成甘油三酯的能力有限，未形成甘油三酯的脂肪酸從脂肪組織游離，并沉積于骨骼肌、肝臟等組織，導(dǎo)致靶器官的胰島素敏感性降低；高濃度的游離脂肪酸（FFA）誘發(fā)血脂紊亂并具有脂毒性，促進(jìn)炎癥形成；脂肪因子功能發(fā)生轉(zhuǎn)化，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促進(jìn)脂肪因子ASP大量產(chǎn)生，降低C5L2的表達(dá)、ASP和C5L2的結(jié)合率等環(huán)節(jié)，導(dǎo)致肥胖機(jī)體出現(xiàn)促?；鞍椎挚梗ˋSP res

4、istance），同時(shí)存在瘦素（leptin resistance）抵抗和胰島素抵抗(insulin resistance, IR)等，出現(xiàn)以血脂紊亂、心血管疾病、中心性肥胖、2型糖尿病為癥候群的代謝綜合征（MS）。
　　非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)（non-neuronal acetylcholinergic system, NNAs）是一類(lèi)存在于脂肪細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等多種非神經(jīng)元細(xì)胞和組織中的膽堿能系統(tǒng)。非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)通過(guò)遞質(zhì)乙酰

5、膽堿與靶細(xì)胞上的膽堿能受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和激素的信息交流、細(xì)胞及周?chē)h(huán)境的信號(hào)傳遞，廣泛調(diào)控體內(nèi)生理、病理過(guò)程。脂肪組織通過(guò)自分泌和（或）旁分泌等方式分泌脂肪因子，并且脂肪因子與各組織、系統(tǒng)形成交互網(wǎng)絡(luò)，參與糖、脂代謝，免疫功能等。活化非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)可以改善胰島素敏感性，該作用與調(diào)控脂肪因子的表達(dá)密切相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)尼古丁長(zhǎng)期暴露使正常嚙齒類(lèi)動(dòng)物和吸煙者的體重較無(wú)尼古丁暴露者體重低，并且戒煙后體重增加；Liu等發(fā)現(xiàn)尼

6、古丁通過(guò)長(zhǎng)期刺激 nAChRs調(diào)節(jié)脂肪因子的釋放，進(jìn)而增加胰島素的敏感性；研究發(fā)現(xiàn)活化的α7型煙堿樣乙酰膽堿受體（α7nAChR）具有控制機(jī)體炎癥、降低體重、改善胰島素敏感性和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌等重要的功能；而缺乏α7nAChR，尼古丁刺激不能降低機(jī)體體重和改善胰島素抵抗，由此可知，α7nAChR在調(diào)控代謝參數(shù)方面具有舉足輕重的作用。研究α7nAChR介導(dǎo)的非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)的活化在抑制ASP-C5L2信號(hào)通路促成脂作用，可為防治飲食源

7、性肥胖提供新的視角。
　　本文通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)主要研究α7 nAChR的功能狀態(tài)在調(diào)控ASP-C5L2信號(hào)通路合成甘油三酯的分子機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肥胖模型小鼠接受尼古丁或（和）甲基牛扁亭堿或氧化六烴季銨注射3周，檢測(cè)不同組小鼠體重、血糖、血TG、血ASP水平，檢測(cè)C5L2 mRNA在不同組小鼠脂肪組織、肝臟、骨骼肌、腎臟等組織表達(dá)的影響；檢測(cè)α7nAChR蛋白在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪組織表達(dá)的水平

8、；在體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)脂肪組織給予PNU282987預(yù)處理24小時(shí)和（或）渥曼青霉素（Wortmannin）預(yù)處理30分鐘，檢測(cè)活化α7nAChR介導(dǎo)的非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)的活化對(duì) ASP誘導(dǎo)的AKT/PKB Ser473磷酸化水平的影響。研究α7nAChR的功能狀態(tài)影響ASP-C5L2信號(hào)下游通路甘油三酯的合成，從而為尋找以α7nAChR作為治療肥胖以及肥胖相關(guān)并發(fā)癥的一個(gè)新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法
　　1. C57BL/

9、6J雄性小鼠（5-6W齡）隨機(jī)分為高脂飲食組（HFD組）和低脂飲食組（LFD組）。HFD組給予高脂飲食（D12492配方）、LFD組給予普通飲食，飼養(yǎng)16周-18周，期間間斷補(bǔ)充蛋黃、葵花籽等高蛋白食物。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)，飲食、大小便，活動(dòng)、皮毛色澤，每周換墊料、刷洗籠子、稱(chēng)重并記錄。
　　2.喂養(yǎng)12周后的各組小鼠接受藥物注射。HFD組和LFD組分別分為4組：鹽水（NS）組、尼古?。∟IC）組、尼古丁和甲基牛扁亭堿（NIC

10、+MLA）組、尼古丁和氧化六烴季銨(NIC+HEX)組。NS組：生理鹽水10ml/kg/day，ip，Bid；NIC組：尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid；NIC+MLA組：甲基牛扁亭堿3 mg/kg/day, ip，Bid，尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid（甲基牛扁亭堿先于尼古丁30分鐘注射）；NIC+HEX組：氧化六烴季銨5 mg/kg/day, ip，Bid，尼古丁1 mg/kg/day, ip，Bid（氧化

11、六烴季銨先于尼古丁30分鐘注射）。給藥時(shí)間：9：30，21：30。連續(xù)給藥21d，并記錄每天的體重。
　　3.給藥結(jié)束，各組小鼠在取材前相繼接受腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（IPGTT）和腹腔注射胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（IPITT）,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間每組小鼠均有3天恢復(fù)期；經(jīng)小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分別采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血促酰化蛋白（ASP）的水平、采用GPO-PAP法檢測(cè)各組小鼠血甘油三脂（TG）的水平；取睪周脂肪組織、肝臟左外葉、腎臟、骨

12、骼肌等組織，采用熒光定量PCR法檢測(cè)C5L2mRNA在上述組織的表達(dá)水平。采用Western Blot檢測(cè)α7nAChR在HFD小鼠和LFD小鼠脂肪組織表達(dá)情況。
　　4.體外脂肪組織培養(yǎng)：脂肪組織分為4組，每組2個(gè)復(fù)孔。分為對(duì)照（PBS）組、?；碳さ鞍祝ˋSP）組、PNU282987+?；碳さ鞍祝≒NU+ASP）組、PNU282987+渥曼青霉素+ASP（PNU+WOR+ASP）組。給予方法： ASP組：ASP100nM/L

13、，溫箱孵育10分鐘；PNU+ASP組：PNU28298710nM/L溫箱孵育24h，棄舊培養(yǎng)基，添加1ml新鮮的培養(yǎng)基，ASP100nM/L，溫箱孵育10分鐘；PNU+WOR+ASP組：渥曼青霉素200nM/L溫箱孵育30分鐘，棄舊培養(yǎng)基，添加1ml新鮮的培養(yǎng)基；PNU28298710nM/L溫箱孵育24h后，然后再次更換1ml新鮮培養(yǎng)基；添加 ASP100nM/L，溫箱孵育10分鐘。采用Western Blot檢測(cè)各組AKT/PKB

14、Ser73磷酸化水平。
　　5.采用 SPSS17.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用?x±s表示。實(shí)驗(yàn)組和其對(duì)照組以及兩比較組間使用 t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1. HFD小鼠和LFD小鼠的體重隨著喂養(yǎng)時(shí)間不斷增加，在喂養(yǎng)前4周，HFD組和LFD組小鼠的體重相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第8周，與LFD組小鼠體重相比較，HFD小鼠體重顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00

15、01)。
　　2.在3周經(jīng)腹腔注射藥物始末，各組小鼠體重的增量比較：HFD小鼠NS組體重較LFD小鼠NS組體重顯著增加（P<0.05）。在HFD小鼠，NIC組小鼠體重較NS組小鼠體重明顯降低(P<0.001)；NIC+MLA組(P<0.05)以及NIC+HEX組(P<0.001)體重較NIC組顯著增加，NIC+MLA組小鼠體重較NIC+HEX組小鼠體重低（P<0.05)）。在LFD小鼠，NIC組體重較NS組降低(P<0.05)；N

16、IC組與NIC+MLA組、NIC+HEX組小鼠體重，三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.各組血ASP和TG水平:HFD小鼠 NS組血TG水平較LFD小鼠 NS組明顯增高(P<0.05)。在HFD小鼠，NIC組血TG水平較NS組血TG水平明顯降低(P<0.05)； NIC+MLA組、NIC+HEX組較NIC組血TG水平顯著增高。在LFD小鼠，血TG水平在NS組、NIC組、NIC+MLA組、NIC+HEX組四組之間沒(méi)有顯著差異。

17、>　　HFD小鼠NS組血ASP水平較LFD小鼠 NS組血ASP水平明顯增高(P<0.05)。在HFD小鼠，NIC組血ASP水平較NS組血ASP水平明顯降低(P<0.05)；NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組的血ASP水平，三組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在LFD小鼠，血ASP水平在NS組、NIC組、NIC+MLA組、NIC+HEX組四組之間沒(méi)有顯著差異。
　　4.血糖：與LFD NS組小鼠的空腹血糖相比較，HFD NS組小鼠

18、的空腹血糖較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在HFD小鼠，NIC組小鼠的空腹血糖水平與NS組小鼠的空腹血糖相比較，NIC組小鼠的空腹血糖水平低（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NIC組和NIC+MLA組、NIC+HEX組小鼠的空腹血糖，三組之間的空腹血糖水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在LFD小鼠，NIC組小鼠的空腹血糖水平與 NS組小鼠的空腹血糖相比較， NIC組小鼠的空腹血糖水平低（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NIC組小鼠的

19、空腹血糖水平比較，NIC+MLA組小鼠的空腹血糖（P<0.001）與 NIC+HEX組小鼠的空腹血糖（P<0.01）均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5. HFD小鼠NS組較LFD小鼠NS組具有較高的血葡萄糖水平，HFD小鼠NS組IPGTT曲線下面積更大；與NS相比，HFD小鼠和LFD小鼠的NIC組血葡萄糖水平低，NIC組具有明顯改善的IPGTT曲線。在HFD小鼠，NIC+MLA組較NIC組具有較高的血葡萄糖水平。在LFD小鼠，NI

20、C組、NIC+MLA組以及 NIC+HEX組的糖耐量，三組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HFD小鼠的糖耐量實(shí)驗(yàn)，與NS組小鼠的血葡萄糖相比，NIC組小鼠的血葡萄糖水平在注射胰島素后30min,60min和90min顯著降低，NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組之間血葡萄糖水平隨胰島素注射后時(shí)間變化沒(méi)有明顯差異。
　　6.與LFD小鼠AUC比較，HFD小鼠AUC顯著增多(P<0.01)。在HFD小鼠，NIC組AUC顯著小于NS組(

21、P<0.01)。NIC組、NIC+MLA組和NIC+HEX組三者的 AUC沒(méi)有明顯差異。在 LFD小鼠，NIC組 AUC小于 NS組 AUC(P<0.05)；NS組、NIC+MLA組和NIC+HEX組三者的AUC沒(méi)有明顯差異。
　　7. C5L2mRNA在各組睪周脂肪組織、肝臟左外葉、腎臟、骨骼肌等組織的表達(dá)情況：與 LFD小鼠NS組相比，HFD小鼠NS組C5L2mRNA在肝臟左外葉(P<0.01)、脂肪組織(P<0.001)、腎

22、臟(P<0.001)、骨骼肌組織(P<0.05)表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在HFD小鼠，與NS組相比，NIC組C5L2基因在脂肪組織(P<0.05)、肌肉組織表達(dá)增高(P<0.05)，而在肝臟組織表達(dá)降低(P<0.001)；NIC+MLA組較NIC組C5L2基因在肝臟組織表達(dá)增加(P<0.01)。在LFD小鼠，與 NS組比較，NIC組 C5L2基因在脂肪組織（P<0.001）、肝臟（P<0.001）、骨骼肌(P<0.05)、腎臟

23、(P<0.001)表達(dá)降低；NIC+MLA組(P<0.001)和NIC+HEX組(P<0.01)較NIC組C5L2基因在肝臟組織表達(dá)較低。NIC+MLA組和NIC+HEX組與NIC組相比，C5L2基因在脂肪組織、腎臟組織、骨骼肌組織表達(dá)沒(méi)有明顯差異。
　　8.α7nAChR蛋白在小鼠脂肪組織表達(dá)，并且α7nAChR蛋白在HFD小鼠脂肪組織表達(dá)水平較在LFD小鼠脂肪組織表達(dá)低（P=0.0379），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9.與

24、PBS組相比，ASP組Akt蛋白的磷酸化水平顯著增高( P=0.0379)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PNU282987預(yù)孵育24小時(shí)，降低了ASP(P=0.0292)誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平。渥曼青霉素+PNU282987+ASP組與ASP組兩組相比較，兩組Akt蛋白的磷酸化水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　α7nAChR介導(dǎo)的非神經(jīng)元型煙堿樣膽堿能系統(tǒng)的活化通過(guò) PI3K-AKT抑制ASP-C5L2下游信號(hào)通路促成酯作用