α7nAChR對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管生成功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)是以骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增殖且腫瘤細(xì)胞與骨髓微環(huán)境密切聯(lián)系來支撐MM細(xì)胞生長和增殖，為主要特征的一種惡性腫瘤。MM的發(fā)病率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％左右，MM具有侵襲性強(qiáng)、易耐藥和血管生成顯著等特點(diǎn)，使絕大多數(shù)患者進(jìn)入難治或復(fù)發(fā)階段。因此對MM的治療提出新的挑戰(zhàn)，也使其成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)。α7尼古丁乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetyl

2、choline receptor，α7nAChR），是尼古丁乙酰膽堿受體的一個(gè)亞型。α7nAChR廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，近年來發(fā)現(xiàn)其在上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞等細(xì)胞上也有表達(dá);其生物學(xué)功能也涉及到了認(rèn)知、炎癥調(diào)控、癌癥發(fā)展等多個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)給予膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊可促進(jìn)缺血組織中的血管新生，使用α7nAChR抑制劑MG624可以抑制肺癌中的血管新生。有文獻(xiàn)報(bào)道，在MM的發(fā)生發(fā)展過程中，血管生成具有十分重要的作用。201

3、3白血病雜志也指出，骨髓瘤患者預(yù)后效果與血管生成關(guān)系密切，當(dāng)患者骨髓中新生血管顯著增多時(shí)，患者一般預(yù)后較差。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知的最重要的正向調(diào)控血管生成的細(xì)胞因子，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如胃癌，鼻咽癌及骨髓瘤等。且研究發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達(dá)可能與MM的血管生成及不良預(yù)后有關(guān)。源自于神經(jīng)外胚層及中胚層細(xì)胞的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibr

4、oblast growthfactor，bFGF)也是研究較多的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子之一。bFGF在多種惡性腫瘤中也存在過表達(dá)的現(xiàn)象，可與VEGF協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。有研究指出血小板反應(yīng)素-1(Thrombospondln-1，TSP-1)又稱為血小板反應(yīng)蛋白-1，是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，主要由血小板，內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等分泌，可通過直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移以及拮抗VEGF來發(fā)揮抑制血管生成的作用。研究表明，

5、TSP-1可作為前列腺癌，甲狀腺乳頭癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。目前關(guān)于α7nAChR與MM尚無研究報(bào)道。因此，本課題圍繞α7nAChR是否在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞促血管生成的過程中發(fā)揮作用開展研究并探討其可能的機(jī)制。
　　研究內(nèi)容及結(jié)果:
　　選取MM細(xì)胞株U266及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)為主要的研究對象，并利用PNU-282987（

6、α7nAChR的選擇性激動劑）和MLA（α7nAChR的選擇性拮抗劑）為主要的研究藥物，利用細(xì)胞與細(xì)胞之間通過Transwell小室間接共培養(yǎng)方式來模擬骨髓微環(huán)境，進(jìn)而開展研究。
　　1.U266細(xì)胞表達(dá)α7nAChR
　　利用Western blot檢測U266細(xì)胞中α7nAChR蛋白表達(dá)，選取RAW264.7及HUVECs作為α7nAChR表達(dá)的陽性對照。結(jié)果提示，U266細(xì)胞也表達(dá)α7nAChR。激光共聚焦顯微鏡下檢測

7、到U266細(xì)胞可被α7nAChR抗體（綠色熒光，主要分布在細(xì)胞膜）及DAPI（藍(lán)色熒光，主要分布在細(xì)胞核）共定位，也進(jìn)一步證明U266細(xì)胞表達(dá)α7nAChR。
　　2.不同濃度的PNU-282987對U266細(xì)胞活力的影響
　　采用CCK8檢測不同濃度的α7nAChR激動劑PNU-282987(1，10，50μM)處理U266細(xì)胞6h后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)50μM的PNU-282987使U266細(xì)胞活力下降;1μM和10μM的P

8、NU-282987對U266細(xì)胞活性幾乎無影響。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取10μM的PNU-292987預(yù)處理U266細(xì)胞6h。
　　3.不同濃度的MLA對U266細(xì)胞活力的影響
　　采用CCK8檢測不同濃度α7nAChR拮抗劑MLA(100，200，300，400，500μM)處理U266細(xì)胞6h后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)300μM，400μM及500μM的MLA使U266細(xì)胞活力下降;100μM和200μM的MLA對U266細(xì)胞活性影響不明

9、顯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取200μM的MLA預(yù)處理U266細(xì)胞6h。
　　4.PNU-282987對HUVECs細(xì)胞活力及小管生成能力的無明顯影響
　　選用PNU-282987(10μM)預(yù)處理細(xì)胞24h，然后測定HUVECs的細(xì)胞活力及小管生成能力。發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.U266與HUVECs共培養(yǎng)，測定HUVECs的小管生成能力
　　選用PNU-282987(10μM), MLA(200μM

10、), MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)預(yù)處理U266細(xì)胞6h后，去掉藥物，將其與預(yù)先鋪板的HUVECs共培養(yǎng)，測定共培養(yǎng)24h后的HUVECs小管生成能力。結(jié)果表明，和單獨(dú)培養(yǎng)HUVECs相比，U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)后可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預(yù)處理之后的U266細(xì)胞再與HUVECs共培養(yǎng)，可使其促進(jìn)HUVECs的小管生成能力下降;使用α7nAChR的拮抗劑MLA(200μM)+PNU

11、-282987(10μM)預(yù)處理U266細(xì)胞后與HUVECs共培養(yǎng)，能夠阻斷PNU-282987預(yù)處理U266導(dǎo)致的共培養(yǎng)后HUVECs小管生成能力下降的現(xiàn)象。另外使用MLA單獨(dú)或與PNU-282987聯(lián)合處理U266細(xì)胞6h后再將其與HUVECs共培養(yǎng)，與U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)后的HUVECs的小管生成能力相比，其差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.PNU-282987激動U266細(xì)胞的α7nAChR會降低共培養(yǎng)后HUVEC

12、s的小管生成能力，可能與bFGF的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)
　　VEGF是主要的血管生長促進(jìn)因子，TSP-1是內(nèi)源性的抑制血管生長因子。由前期結(jié)果可知，U266細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)24h后，可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預(yù)處理U266細(xì)胞后，促HUVECs小管生成能力卻下降。這一現(xiàn)象說明，U266細(xì)胞可能產(chǎn)生某些促血管生成因子或減少了抑制血管生成因子的釋放，經(jīng)PNU-282987預(yù)處理后，這一作用被抑制。
　　為

13、了探討可能的機(jī)制，我們首先選用ELISA檢測U266細(xì)胞經(jīng)PNU-282987(0，10μM)預(yù)處理6h及去掉藥物作用繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF及TSP-1的含量。結(jié)果表明，PNU-282987并不影響U266細(xì)胞分泌VEGF及TSP-1的水平。然后我們選用血管生成相關(guān)細(xì)胞因子抗體芯片（同時(shí)檢測20個(gè)血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子）對去掉PNU-282987(0，10μM)作用后繼續(xù)培養(yǎng)24h的U266細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PN