α5-nAChR-STAT3反饋調節(jié)環(huán)路在尼古丁促非小細胞肺癌細胞增殖中的作用及機制.pdf

1、[背景]
　　肺癌是一種常見的肺部惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率均居癌癥之首，其中非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌類型85％以上。吸煙是誘發(fā)肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)境因素之一。煙草中最重要的成癮成分尼古丁可通過結合并激活尼古丁乙酰膽堿受體(Nicotinic AcetylcholineReceptors，nAChR)，促進肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。近年來，全基因組關聯(lián)研究(GW

2、AS)表明，位于15號染色體長臂，編碼尼古丁乙酰膽堿受體CHRNA5/A3/B4基因簇的變異與吸煙相關性肺癌密切相關。其中，編碼α5-尼古丁乙酰膽堿受體(α5-nAChR)的基因CHRNA5與肺癌的發(fā)生發(fā)展尤為相關，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用及機制尚不明確。
　　尼古丁結合肺癌細胞膜表面nAChRs，引起nAChRs通道構象發(fā)生變化，并激活下游多重信號通路。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，α5-nAChR可激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號

3、通路影響尼古丁誘導的肺癌細胞增殖、轉移及侵襲，初步驗證其在肺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為了進一步闡明α5-nAChR在肺癌發(fā)生中的作用和機制，我們通過對CHRNA5啟動子區(qū)域進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，其啟動子區(qū)域具有信號轉導及轉錄激活因子STAT3的結合位點，但是α5-nAChR與STAT3之間相互作用關系以及對肺癌細胞功能的影響未見報道。
　　本課題擬研究α5-nAChR、STAT3在非小細胞肺癌組織標本中的表達及與相關臨床病理參數(shù)的

4、關系，同時分析α5-nAChR/STAT3反饋調節(jié)環(huán)路在尼古丁誘導非小細胞肺癌細胞增殖過程中的作用及機制，將有助于進一步明確α5-nAChR在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用，對于進一步研究NSCLC的防治具有重要的理論意義和實際應用前景。
　　[目的]
　　1.檢測NSCLC組織中α5-nAChR與pSTAT3的表達，并分析與吸煙史、生存期等相關臨床病理參數(shù)的相關性;
　　2.體外研究NSCLC細胞中α5-nAC

5、hR與STAT3相互調節(jié)作用的機制及在尼古丁促進NSCLC細胞增殖中的作用。
　　[方法]
　　1.通過免疫組化方法檢測NSCLC組織病理標本中α5-nAChR和STAT3表達;并分析α5-nAChR的表達與患者吸煙史之間關系。
　　2.通過在線數(shù)據庫分析α5-nAChR的表達對吸煙相關性肺腺癌患者生存和生存期的影響，同時通過患者病例資料，使用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，分析α5-nAChR與pST

6、AT3表達雙陽性對肺腺癌患者生存期的影響。
　　3.NSCLC細胞系在尼古丁作用下，通過Western blot方法檢測α5-nAChR、pSTAT3和tSTAT3的表達變化。
　　4.設計合成針對CHRNA5基因的小干擾RNA片段，經lipo2000介導轉染A549和H1299 NSCLC細胞，Western blot和RT-PCR方法分別檢測尼古丁處理組、siRNA-CHRNA5組和（尼古丁+siRNA-CHRNA5組）

7、中α5-nAChR和下游JAK2/STAT3的表達變化。
　　5.ChIP實驗檢測NSCLC細胞中STAT3與CHRNA5啟動子區(qū)域有無結合位點。
　　6.設計合成針對STAT3基因小干擾RNA片段，經lipo2000介導轉染A549細胞，Western blot和RT-PCR方法分別檢測尼古丁處理組、siRNA-STAT3組和（尼古丁+siRNA-STAT3組）中STAT3、JAK2及α5-nAChR的表達變化。
　

8、　7.CCK-8方法檢測干擾α5-nAChR和/或STAT3后對尼古丁促進NSCLC細胞增殖的影響。
　　[結果]
　　1.免疫組織化學結果顯示，在130例NSCLC組織病理標本中，α5-nAChR和STAT3的陽性表達率分別為60％和66.9％，在87例STAT3高表達的肺癌組織中，其中有58例α5-nAChR表達水平提高，差異顯著(P＜0.05)。此外在55例NSCLC患者組織病理標本中，25例患者有吸煙史，其中19例α

9、5-nAChR表達陽性，表明α5-nAChR表達和吸煙史密切相關且有統(tǒng)計學意義(P=0.022)。
　　2.數(shù)據庫結果顯示，在具有吸煙史的肺腺癌患者中，α5-nAChR表達陽性的患者生存期明顯低于α5-nAChR表達陰性的患者(P＜0.05)。同時Kaplan-Meier法計算生存率并繪制生存曲線分析，α5-nAChR(+)/STAT3(+)的患者生存期明顯比α5-nAChR（-）/STAT3(+)(P=0.034)和α5-nAC

10、hR(+)/STAT3（-）(P=0.026)的患者低。
　　3.Western blot檢測結果顯示，相對于對照組，1μM尼古丁刺激A549、H1299和H1975 NSCLC細胞系16h后，α5-nAChR和pSTAT3在蛋白水平表達均升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但tSTAT3蛋白水平不發(fā)生變化。
　　4.siRNA-CHRNA5轉染A549、H1299 NSCLC細胞后，與陰性對照組相比，siRNA-CH

11、RNA5組α5-nAChR、JAK2和STAT3表達水平下降(P＜0.05)，與1μM尼古丁組相比，（1uM尼古丁+siRNA-CHRNA5）組，α5-nAChR、JAK2和STAT3表達水平下降(P＜0.05)。
　　5.ChIP實驗結果表明，CHRNA5啟動子區(qū)域具有pSTAT3蛋白轉錄結合位點，1μM尼古丁刺激A549細胞后，pSTAT3與CHRNA5啟動子區(qū)域結合明顯增加(P＜0.05)，當siRNA-STAT3轉染肺癌細

12、胞后，pSTAT3與CHRNA5啟動子區(qū)域結合降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.siRNA-STAT3轉染A549細胞后，與陰性對照組相比，siRNA-STAT3組α5-nAChR、JAK2和STAT3表達水平下降(P＜0.05)，與1uM尼古丁組相比，(1uM尼古丁+siRNA)轉染組，5-nAChR、JAK2和STAT3表達水平下降(P＜0.05)。
　　7.通過A549、H1299細胞CCK-8實驗

13、，對比陰性對照組，發(fā)現(xiàn)siRNA-CHRNA5和/或siRNA-STAT3轉染組NSCLC細胞增殖抑制較陰性對照組升高(P＜0.05)。在1μ M尼古丁組，與尼古丁+siRNA-CHRNA5/siRNA-STAT3轉染組相比，轉染組細胞增殖明顯受抑制(P＜0.05)。
　　[結論]
　　1.在NSCLC組織中，α5-nAChR表達明顯高于癌旁組織，且和患者吸煙史1密切相關，α5-nAChR高表達伴隨著患者較低的生存率，提示α