miR-675-5p在非小細(xì)胞肺癌中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人的身體健康和生命安全。肺癌按組織學(xué)分類一般分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌，其中前三種臨床常見并統(tǒng)稱為非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，約占全部肺癌的80％。肺癌患者早期一般無明顯癥狀，當(dāng)確診時(shí)多數(shù)已經(jīng)是肺癌晚期。近年，盡管以外科為主的綜合治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但其5年存活率仍然不足15％。目前唯一能有效提高NSCL

2、C長(zhǎng)期生存率的辦法就是做到早診斷早治療，而要做到早診斷，明確NSCLC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有著至關(guān)重要的作用。
　　miRNAs是生物體內(nèi)具有調(diào)控功能的一類非編碼RNA(長(zhǎng)度大約19-24個(gè)核苷酸)，其主要通過與靶基因3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。大量研究表明多種腫瘤組織中存在miRNA異常表達(dá)且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性;也可作為癌基

3、因，下調(diào)抑癌基因的活性。因此，其作為一類新的分子研究靶點(diǎn)已受到腫瘤等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域極大關(guān)注。
　　由于RNA測(cè)序(RNA-seq)和miRNA芯片雜交方法的廣泛應(yīng)用，許多惡性腫瘤的miRNA表達(dá)譜得以建立，其中一些miRNA已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)和預(yù)后的標(biāo)志物。miRNA在NSCLC中的研究也越來越多，隨著研究的不斷深入，大量的miRNA在NSCLC中的作用得以明確。最近文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-675在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、肝癌等多種惡

4、性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且通過調(diào)控Cadherin13、RUNX1(Runt Domain Transcription Factor1)、Twist1(twist basichelix-loop-helix transcription factor1)等不同的靶基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展;而另有研究卻發(fā)現(xiàn)miR-675在腎上腺皮質(zhì)癌組織中表達(dá)下調(diào)。提示不同的腫瘤中miR-675的表達(dá)及其作用存在不同。miR-675在NSCLC中的表達(dá)情況以及是

5、否影響其生物學(xué)特性和相關(guān)的作用機(jī)制至今未見文獻(xiàn)報(bào)告。本項(xiàng)目擬采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫組織化學(xué)等方法分析miR-675-5p在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平及其臨床病理意義;在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討改變miR-675-5p的表達(dá)水平分析其對(duì)NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的影響以及在癌變作用的機(jī)制。為確立miR-675-5p作為抗NSCLC治療的新靶點(diǎn)及預(yù)后的分子標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:1.收集35例臨床資料齊全NSCLC病

6、人標(biāo)本（癌組織與配對(duì)癌旁組織），實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-675-5p在NSCLC癌組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)水平，分析miR-675-5p表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2.構(gòu)建LV-miR-675-precursor和LV-miR-675-5p-inhibition慢病毒載體并包裝制備病毒（隨機(jī)任意序列為陰性對(duì)照），感染NSCLC細(xì)胞A549和HTB-182，獲得miR-675-5p穩(wěn)定表達(dá)上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞株

7、，分析上調(diào)和下調(diào)miR-675-5p的表達(dá)對(duì)A549和HTB-182細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移以及裸鼠移植成瘤等生物學(xué)方面的影響。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-675-5p靶基因，構(gòu)建含靶基因3'-UTR的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和HTB-182細(xì)胞并檢測(cè)其熒光素酶活性;Western雜交檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)miR-675-5p后A549和HTB-182細(xì)胞中靶基因GPR55表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)檢測(cè)上調(diào)miR-675-5

8、p后A549細(xì)胞成瘤體后組織中GPR55表達(dá)，確定 miR-675-5p是否直接作用于預(yù)測(cè)靶基因GPR55的3'-UTR且影響其表達(dá)。
　　4、非小細(xì)胞肺癌及肺正常組織芯片，免疫組織化學(xué)分析靶基因GPR55蛋白在NSCLC中的表達(dá)水平及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　5.構(gòu)建siRNA-GPR55干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株A549-LV-miR-675-5p-inhibition，進(jìn)一步分析敲降靶基因GPR55后是否阻斷或降低miR-67

9、5-5p下調(diào)對(duì)NSCLC細(xì)胞A549生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移以及裸鼠成瘤促進(jìn)作用。
　　結(jié)果:1.miR-675-5p在非小細(xì)胞肺癌的癌組織中平均表達(dá)水平與其配對(duì)的癌旁組織相比明顯下調(diào)（P＜0.05），且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期成負(fù)性相關(guān);與永生化的人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE相比，miR-675-5p在6株NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)也明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　2.建立miR-675-5p穩(wěn)定表達(dá)上調(diào)細(xì)胞株(A549-LV-miR

10、-675-precursor及HTB-182-LV-miR-675-precursor)和miR-675-5p穩(wěn)定表達(dá)下調(diào)細(xì)胞株(A549-LV-miR-675-5p-inhibition及HTB-182-LV-miR-675-5p-inhibition)，下調(diào)miR-675-5p的表達(dá)，體外可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞A549和HTB-182的生長(zhǎng)增殖、克隆形成、侵襲遷移，體內(nèi)可促進(jìn)移植裸鼠成瘤的生長(zhǎng)（P＜0.05）;上調(diào)miR-675-

11、5p的表達(dá)則顯著抑制NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移以及裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示GPR55是miR-675-5p的直接作用靶基因，上調(diào)或下調(diào)miR-675-5p表達(dá)可以導(dǎo)致GPR55蛋白表達(dá)水平下調(diào)或上調(diào)。
　　4.與永生化的人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE相比，GPR55在6株NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào);與肺正常組織相比，GPR55蛋白在NSCLC組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.

12、05)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成相關(guān)。
　　5.下調(diào)A549-LV-miR-675-5p-inhibition細(xì)胞GPR55表達(dá)后，可顯著阻斷miR-675-5p下調(diào)對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲遷移及裸鼠移植瘤瘤體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)miR-675-5p調(diào)控靶基因GPR55表達(dá)參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論:1.miR-675-5p在NSCLC組織中的表達(dá)水平下調(diào)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期成負(fù)相關(guān)。
　　2.上