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文檔簡介
1、肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(Myofibrillogenesisregulator1,MR-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的人類功能基因,以往研究表明MR-1與心肌細(xì)胞重構(gòu)、收縮及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程相關(guān),該基因在心肌肥大細(xì)胞和白血病細(xì)胞中高表達(dá)。闡明該基因在腫瘤發(fā)生以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用及其機(jī)理,將有助于腫瘤的診斷與防治。本研究主要目的是探索MR-1基因在腫瘤細(xì)胞增殖、粘附和遷移過程中的作用及機(jī)制,闡明MR-1作為一個(gè)腫瘤治療的新靶點(diǎn)的可行性。研究結(jié)果
2、如下: 1.MR-1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與定位 對(duì)人正常細(xì)胞以及不同腫瘤細(xì)胞中MR-1mRNA以及蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,在人腫瘤細(xì)胞中MR-1的表達(dá)高于正常細(xì)胞,提示MR-1有可能為腫瘤相關(guān)基因。其中人肝癌細(xì)胞HepG2表達(dá)水平最高。我們構(gòu)建了MR-1和綠色熒光蛋白融合表達(dá)的載體,并將它轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MR-1和綠色熒光融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。 2.MR-1表達(dá)下調(diào)引起的細(xì)胞生物學(xué)行為改變
3、 RNA干擾技術(shù)主要通過外源導(dǎo)入與靶基因mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA,從而抑制靶基因的蛋白表達(dá)。本研究選取MR-1表達(dá)水平最高的HepG2細(xì)胞,通過化學(xué)合成的21個(gè)核苷酸的短干擾核糖核酸(siRNA)干擾降低HepG2細(xì)胞中MR-1的表達(dá)水平,觀察細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生的變化。根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)并合成了2個(gè)siRNA干擾序列。轉(zhuǎn)染細(xì)胞36小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MR-1蛋白的表達(dá)水平,選擇抑制效果最好的序列,進(jìn)行后續(xù)工作的研究。 生長
4、曲線法以及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖速率的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)MR-1-siRNA處理后,HepG2細(xì)胞生長速度明顯減慢,克隆形成率抑制率為66.81%。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)siRNA處理后,細(xì)胞3小時(shí)內(nèi)穿過8μm濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的37.27%。細(xì)胞基質(zhì)粘附試驗(yàn)檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)細(xì)胞與基質(zhì)之間粘附能力的影響。結(jié)果
5、顯示,經(jīng)MR-1-siRNA處理后,細(xì)胞對(duì)纖維粘連蛋白(FN)的粘附能力下降。結(jié)果說明MR-1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長,運(yùn)動(dòng)以及粘附。 3.HepG2/MR-1(-)細(xì)胞的生物學(xué)行為改變 我們構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達(dá)MR-1-shRNA的pCD-sh-MR-1載體,并將它穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,進(jìn)行單克隆培養(yǎng)后,建立MR-1穩(wěn)定沉默的HepG2/MR-1(-)細(xì)胞系。作為對(duì)照,建立了HepG2/mock細(xì)胞系。 對(duì)HepG
6、2/MR-1(-)細(xì)胞系的生物學(xué)行為進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示其體外增殖速率顯著降低,克隆形成率抑制率為31.77%;細(xì)胞遷移能力明顯下降,抑制率為56.55%:HepG2/MR-1(-)細(xì)胞對(duì)FN的粘附能力在15~90min培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)與HepG2細(xì)胞比較明顯下降;另外,HepG2/MR-1(-)細(xì)胞在FN上的伸展形態(tài)發(fā)生改變,伸展速度下降。體內(nèi)成瘤性試驗(yàn)表明,HepG2/MR-1(-)細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長速率與HepG2細(xì)胞相比明顯降低,抑
7、制率達(dá)91.01%。 4.BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞的生物學(xué)行為改變 采用能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)目的基因的質(zhì)粒pcDNA3.1+,我們構(gòu)建了MR-1高表達(dá)質(zhì)粒-pcDNA3.1-MR-1。將pcDNA3.1-MR-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BEL-7402細(xì)胞中,經(jīng)過單克隆挑選,建立BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞系,Westernblot法檢測(cè),證明該細(xì)胞系中MR-1蛋白的表達(dá)水平顯著增加。同時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1
8、+,建立BEL-7402/EV細(xì)胞系。 生長曲線以及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞系的增殖速率,結(jié)果顯示BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞的增殖速率無明顯改變;劃痕實(shí)驗(yàn)表明BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞越過劃痕的能力明顯增強(qiáng);Transwell試驗(yàn)亦表明,BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞系遷移能力增強(qiáng)29.7%;粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BEL-7402/MR-1(+)在10min,20min,30mi
9、n以及60min培養(yǎng)后對(duì)FN的粘附率明顯增加;另外,細(xì)胞在FN上的伸展速度變快。 5.MR-1在腫瘤增殖、粘附和遷移過程中的作用機(jī)制 酵母雙雜交和體外蛋白結(jié)合試驗(yàn)表明,MR-1可以與肌球蛋白輕鏈2(MLC2)結(jié)合(1)。文獻(xiàn)報(bào)道,MLC2的活性與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。MLC2活化后肌球蛋白即可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合,促進(jìn)張力纖維的聚合,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(2’3)。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移是一個(gè)整體連續(xù)的過程,該過程與細(xì)胞與基質(zhì)
10、的粘附有關(guān)(4)。當(dāng)細(xì)胞與基質(zhì)發(fā)生粘附后,粘著斑激酶(FAK)激活,F(xiàn)AK可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活[5,6]。在此基礎(chǔ)上,我們開展了MR-1的作用機(jī)制研究。 (1)MR-1對(duì)MLC2、FAK和Akt磷酸化和張力纖維形成的影響 檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)MLC2磷酸化水平以及張力纖維形成的影響,結(jié)果表明MR-1-siRNA處理后,細(xì)胞內(nèi)MLC2蛋白的19位絲氨酸磷酸化水平明顯
11、降低。羅丹明偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)張力纖維的形成,結(jié)果表明MR-1-siRNA處理后,細(xì)胞內(nèi)F-actin的聚集與對(duì)照組細(xì)胞相比明顯受到抑制。說明MR-1通過某種機(jī)制促進(jìn)MLC2的磷酸化,然后影響F-actin的聚集,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。 檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)FAK以及Akt活性的影響,結(jié)果顯示FAK和Akt的磷酸化水平顯著下降。另外,MR-1-siRNA也可抑制FN激活的FAK/Akt活性。說明MR-1通過影響FA
12、K/Akt活性調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及增殖。 (2)MR-1激活MLC2-FAK-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 采用肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)抑制劑、F-actin解聚劑和PI3K抑制劑處理細(xì)胞,檢測(cè)MLC2、FAK和Akt磷酸化水平以及張力纖維的形成,闡明這些蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相互關(guān)系。結(jié)果顯示,給予MLCK抑制劑后,細(xì)胞內(nèi)MLC2磷酸化水平降低,張力纖維形成受抑,同時(shí)FAK/Akt活性發(fā)生顯著降低。給予F-actin解聚劑后,M
13、LC2磷酸化水平上升,而FAK/Akt活性降低,這兩組結(jié)果說明活化的MLC2通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)張力纖維的聚合,作為上游信號(hào)因子調(diào)節(jié)FAK/Akt通路。另外,給予上述抑制劑后,細(xì)胞遷移能力以及生長能力均出現(xiàn)不同程度的下降。 給予PI3K抑制劑后,除細(xì)胞Akt磷酸化水平缺失外,MLC2以及FAK磷酸化水平也發(fā)生不同程度的下降,說明Akt還可通過某種機(jī)制促進(jìn)MLC2活性,從而在細(xì)胞內(nèi)形成正反饋信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移和增殖。而上述
14、三種抑制劑對(duì)MR-1表達(dá)均無影響。另外,當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MR-1使細(xì)胞表達(dá)外源性MR-1后,細(xì)胞內(nèi)MLC2、FAK和Akt磷酸化水平顯著升高,該作用可被MLCK抑制劑阻斷,說明MR-1為該信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子。 (3)MR-1對(duì)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)的影響 采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)MR-1瞬時(shí)沉默細(xì)胞以及MR-1高表達(dá)細(xì)胞中全基因組的變化。HepG2細(xì)胞處理30小時(shí)后,比較MR-1-siRNA處理細(xì)胞與mo
15、ck-siRNA處理細(xì)胞之間基因的差異。結(jié)果顯示MR-1-siRNA處理組細(xì)胞有326個(gè)基因發(fā)生改變,其中192個(gè)基因上調(diào),134個(gè)基因發(fā)生下調(diào)。另外,對(duì)比BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞與BEL-7402/EV細(xì)胞中基因的差異。結(jié)果顯示BEL-7402/MR-1(+)細(xì)胞有1318個(gè)基因發(fā)生了改變,其中338個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào),980個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)。這些受MR-1影響的基因中有很多與細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因分析表明,
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