Nanog陽性肝癌細(xì)胞在肝癌干細(xì)胞層級分化中的地位與作用研究.pdf

1、中國作為肝癌的重災(zāi)區(qū)，肝癌研究的任務(wù)艱巨，盡管近年來手術(shù)、放化療等多種治療手段在不斷進(jìn)步，但肝癌患者的5年生存率仍然很低。隨著人們對腫瘤研究的深入推進(jìn)，大量研究指向腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，找到并研究腫瘤干細(xì)胞賴以維持的條件，進(jìn)而開發(fā)針對性的治療手段成為腫瘤學(xué)研究的一個重要方向，肝癌干細(xì)胞研究也因此被寄予厚望。
　　與黑色素瘤、乳腺癌等具有較為明確的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物不同，在本課題開展之前，多個研究小組已陸續(xù)建立了以C

2、D133、EpCAM、CD90、CD13和CD24等為標(biāo)記物的肝癌干細(xì)胞模型，并且在課題開展過程中新的標(biāo)記物仍在不斷涌現(xiàn)。之所以有如此多的肝癌干細(xì)胞模型出現(xiàn)，其中的一個重要原因是這些標(biāo)記物在各研究小組之間研究結(jié)果的不一致甚至是難以重復(fù)。提示這些標(biāo)記物對于特定研究條件的依賴，也一定程度上反應(yīng)了這些標(biāo)記物自身的不穩(wěn)定性。而這種肝癌干細(xì)胞研究看似表面上的百花齊放，在實質(zhì)上已經(jīng)阻礙了對其更深層次機(jī)制研究的繼續(xù)推行。
　　然而，縱然有這些肝

3、癌干細(xì)胞標(biāo)記物和肝癌干細(xì)胞模型的存在，但實質(zhì)不變的是，這些肝癌干細(xì)胞的維持都依賴于細(xì)胞內(nèi)的干性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此本研究從腫瘤干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的相似性入手，以胚胎干細(xì)胞自我更新維持的核心分子Nanog為標(biāo)記，建立了一套全新的肝癌干細(xì)胞分選模型，并圍繞其生物學(xué)特性、自我更新機(jī)制以及與其他肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物之間的相互關(guān)系展開研究。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步對課題研究過程中發(fā)現(xiàn)的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物自身及相互間轉(zhuǎn)化的新現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探討。
　

4、　本文的主要研究方法、研究結(jié)果如下:
　　1.證明了Nanog可以作為肝癌干細(xì)胞的新標(biāo)記物分子
　　(1)證明Nanog可以作為肝癌預(yù)后的標(biāo)記物。Western Blot證明Nanog在肝癌組織中相對癌旁組織高表達(dá);IHC檢測了Nanog在59例肝癌組織的表達(dá)水平，分析顯示Nanog表達(dá)水平與肝癌臨床復(fù)發(fā)以及包膜和血管浸潤顯著相關(guān)，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示Nanog與患者總生存期和無病生存期顯著相關(guān)。(2)構(gòu)

5、建了由Nanog啟動子驅(qū)動的熒光報告系統(tǒng)。完成Nanog啟動子驅(qū)動的GFP報告慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建，經(jīng)驗證被病毒感染的細(xì)胞中，GFP的表達(dá)強(qiáng)度可以反映內(nèi)源Nanog的表達(dá)水平。(3)證明Nanog陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力。實驗結(jié)果顯示Nanog陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞球形成、克隆形成、體內(nèi)成瘤以及多向分化能力。(4)證明Nanog陽性細(xì)胞具有高侵襲、強(qiáng)耐藥以及慢增殖的特性。Transwell實驗證明Nanog陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移

6、能力，蛋白水平檢測證明Nanog陽性細(xì)胞表現(xiàn)出EMT特征，體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗證明Nanog陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力;細(xì)胞殺傷實驗證明Nanog陽性細(xì)胞對肝癌化療藥物Sorafenib以及順鉑具有更強(qiáng)的抵抗特性，RNA水平檢測證明Nanog陽性細(xì)胞高表達(dá)多個耐藥基因;免疫熒光染色證明Nanog強(qiáng)陽性細(xì)胞中Ki67標(biāo)記陽性率較低，單細(xì)胞增殖實驗表明Nanog強(qiáng)陽性細(xì)胞增殖較慢。
　　2.明確了Nanog陽性肝癌干細(xì)胞的自我更新機(jī)制

7、　　(1)證明Nanog是維持肝癌干細(xì)胞自我更新的必要分子。慢病毒RNA干擾試驗顯示干擾Nanog的表達(dá)可顯著降低細(xì)胞的細(xì)胞球形成能力、克隆形成能力以及遷移能力，并導(dǎo)致細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因Oct4和Sox2表達(dá)下調(diào)而成熟肝細(xì)胞標(biāo)記物AFP、CK8、CK18、TTR表達(dá)上調(diào)。成瘤實驗表明在Nanog陰性細(xì)胞中過表達(dá)Nanog，可明顯提升其成瘤能力，Transwell實驗顯示過表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)。(2)發(fā)現(xiàn)IGF信號通路在Nano

8、g陽性細(xì)胞中激活。全基因表達(dá)譜分析顯示IGF信號通路多個分子在Nanog陽性細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步qRT-PCR驗證表明IGF2及其受體IGF1R在陽性細(xì)胞中顯著上調(diào)。(3)證明Nanog可以調(diào)控IGF1R的表達(dá)水平。Western Blot實驗證明在Nanog陽性細(xì)胞中干擾Nanog可以導(dǎo)致IGF1R下調(diào)，反之在Nanog陰性細(xì)胞中過表達(dá)Nanog則引起IGF1R表達(dá)上調(diào)。ChIP實驗證明Nanog可以結(jié)合到IGF1R啟動子，提示Nan

9、og可能通過激活I(lǐng)GF1R轉(zhuǎn)錄從而上調(diào)其表達(dá)。(4)證明IGF信號可調(diào)控細(xì)胞的自我更新能力以及Nanog的表達(dá)。實驗結(jié)果顯示IGF1R抑制劑PPP和AEW541處理可以顯著降低細(xì)胞的細(xì)胞球形成能力，并同時顯著下調(diào)Nanog的RNA水平。
　　3.明晰了肝癌干細(xì)胞6種標(biāo)記物在肝癌中的分布概況及相關(guān)性
　　(1)明確了肝癌細(xì)胞中6種肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)概況。通過流式細(xì)胞術(shù)對3種肝癌細(xì)胞系和5種肝癌原代細(xì)胞中的CD133、EpC

10、AM、CD90、CD24、CD13以及Nanog總計6種肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CD13和CD24在多數(shù)細(xì)胞中呈高表達(dá)、CD133和EpCAM表達(dá)在細(xì)胞中異質(zhì)性較大、Nanog表達(dá)穩(wěn)定在10％左右、而除SMCC-7721細(xì)胞以外CD90在所檢細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。(2)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞可區(qū)分為高自我更新能力和低自我更新能力兩類。通過克隆形成、細(xì)胞球形成以及體內(nèi)成瘤能力檢測，發(fā)現(xiàn)三種能力在所檢的8種肝癌細(xì)胞中存在顯著差異，并且可以由此

11、將細(xì)胞明顯區(qū)分為高低自我更新能力兩類。(3)發(fā)現(xiàn)CD133和EpCAM的表達(dá)水平可以區(qū)分高低自我更新能力的兩類細(xì)胞。通過對高低自我更新能力的兩類肝癌細(xì)胞中6種標(biāo)記物的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)CD133和EpCAM在高自我更新的肝癌細(xì)胞中比例顯著高于在低自我更新細(xì)胞中的相應(yīng)比例。(4)建立和應(yīng)用了6種肝癌干細(xì)胞共標(biāo)記的方法。通過使用標(biāo)記不同熒光的干細(xì)胞標(biāo)記物，共同標(biāo)記細(xì)胞，通過調(diào)整熒光補(bǔ)償可以將幾類標(biāo)記明顯區(qū)分，繼而利用該方法完成了8種

12、肝癌細(xì)胞6種不同熒光共標(biāo)記的檢測。(5)分析發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)存在有限的特征組合，建立了肝癌中6種干細(xì)胞標(biāo)記物的分布概況圖?；谏鲜?種熒光共標(biāo)記檢測結(jié)果，分析顯示所檢的8種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞主體均分布在有限的標(biāo)記組合中，進(jìn)一步通過對6種標(biāo)記物兩兩間的重疊與包含情況的分析，我們描繪了肝癌中6種干細(xì)胞標(biāo)記物的分布概況圖。
　　4.建立了基于Nanog和CD133為標(biāo)記的肝癌干細(xì)胞層級分化模型
　　(1)分析發(fā)現(xiàn)C

13、D133是高豐度干細(xì)胞標(biāo)記物中對肝癌細(xì)胞自我更新能力區(qū)分最好的標(biāo)記。通過對不同自我更新能力的肝癌細(xì)胞中6種肝癌干細(xì)胞共標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定CD133是高豐度標(biāo)記物中對高低自我更新能力的細(xì)胞區(qū)分度最好的標(biāo)記分子。(2)發(fā)現(xiàn)Nanog相比CD133，對自我更新能力的指示作用更“顯性”。克隆形成和成球能力檢測顯示，兩個標(biāo)記中當(dāng)Nanog標(biāo)記為陽性時，無論細(xì)胞的CD133表達(dá)陽性或者陰性，均表現(xiàn)出更強(qiáng)的自我更新能力。(3)建立了基于CD133

14、和Nanog雙標(biāo)記的肝癌干細(xì)胞層級分化模型。通過細(xì)胞群體和單細(xì)胞分化兩種方法檢測雙標(biāo)記細(xì)胞中細(xì)胞的分化方向，結(jié)果顯示Nanog標(biāo)記的細(xì)胞存在由強(qiáng)到弱、由陽到陰的單向性分化，而CD133標(biāo)記的陰陽以及強(qiáng)弱細(xì)胞間可以相互轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞的成球能力檢測，確定該模型中細(xì)胞的分化方向為 NanogHigh CD133Low/Neg到 NanogHighCD133High到NanogLowCD133Pos/Neg再到NanogNegCD133P

15、os最終到NanogNegCD133Neg。
　　5.闡明了肝癌干細(xì)胞6種標(biāo)記物自身及相互間的轉(zhuǎn)化情況
　　(1)證明肝癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物存在自發(fā)轉(zhuǎn)變。利用流式細(xì)胞儀將6種肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物的陰陽細(xì)胞分開，并分別進(jìn)行群體和單細(xì)胞克隆培養(yǎng)。復(fù)檢結(jié)果顯示在6種肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物中CD133、CD13和CD24三種標(biāo)記物陰性和陽性細(xì)胞間轉(zhuǎn)變較為明顯。其他標(biāo)記中，CD90陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D90陽性細(xì)胞的概率較低;EpCAM陽性細(xì)胞則表現(xiàn)

16、出兩種狀態(tài)，在Huh7細(xì)胞中EpCAM陽性和陰性細(xì)胞間幾乎不轉(zhuǎn)化，而在T1224中則傾向于向EpCAM陽性狀態(tài)轉(zhuǎn)化;Nanog則表現(xiàn)為陽性到陰性的單向轉(zhuǎn)化。(2)證明肝癌干細(xì)胞標(biāo)記的轉(zhuǎn)變不依賴于細(xì)胞分裂。使用4mM的丁酸鈉處理將細(xì)胞阻斷在G0/G1期后，肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物陰性與陽性細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化仍會發(fā)生。(3)發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物間存在相互轉(zhuǎn)變。對肝癌干細(xì)胞的6種標(biāo)記物進(jìn)行兩兩雙標(biāo)記進(jìn)而體外培養(yǎng)并復(fù)測這些標(biāo)記物的表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)Nan

17、og以外的5種表面標(biāo)記物中除CD90，其他表面標(biāo)記分子均存在相互間自發(fā)轉(zhuǎn)變;與此不同，我們發(fā)現(xiàn)Nanog陽性細(xì)胞具有向其他標(biāo)記分子陽性細(xì)胞的單向轉(zhuǎn)變能力，即Nanog陽性細(xì)胞可以產(chǎn)生其余5種標(biāo)記的陽性細(xì)胞，反之這些標(biāo)記物陽性但Nanog陰性的細(xì)胞在常規(guī)條件下均無法轉(zhuǎn)變產(chǎn)生Nanog陽性細(xì)胞。(5)繪制了肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物自身及相互間的轉(zhuǎn)化關(guān)系圖。通過總結(jié)上述Huh7細(xì)胞中各種標(biāo)記物的自身及相互間轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)，得到了這些標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化關(guān)系圖。<

18、br>　　6.初步探明了Nanog陰性細(xì)胞在體內(nèi)特定條件下逆轉(zhuǎn)的條件及其分子機(jī)制
　　(1)發(fā)現(xiàn)Nanog陰性細(xì)胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镹anog陽性細(xì)胞。在Nanog陰性細(xì)胞體內(nèi)所成腫瘤中可檢出有GFP熒光出現(xiàn)，將其中的GFP陽性和陰性細(xì)胞分離出來后進(jìn)行成瘤、克隆形成和成球?qū)嶒灳砻髂孓D(zhuǎn)得到的是有功能的Nanog陽性細(xì)胞。(2)證明Matrigel可以誘導(dǎo)Nanog陰性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。在體外條件下，Nanog陰性細(xì)胞用Matrigel培養(yǎng)，

19、可以產(chǎn)生Nanog陽性細(xì)胞，并且證明逆轉(zhuǎn)得到的陽性細(xì)胞比陰性細(xì)胞具有更強(qiáng)的成球能力。(3)證明Nanog陰性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)是其體內(nèi)成瘤的重要先決條件。構(gòu)建了Nanog攜帶自殺基因TK的慢病毒載體Lv-NTPF以及對照載體Lv-NGPF，Western Blot和流式檢測證明該系統(tǒng)可以有效清除Nanog陽性細(xì)胞;使用上述系統(tǒng)清除Nanog陽性細(xì)胞后，細(xì)胞的克隆形成、成球以及成瘤能力均顯著降低;小鼠體內(nèi)實驗進(jìn)一步證明，在加入TK底物GCV的情況下

20、，攜帶Lv-NTPF的細(xì)胞難以起始腫瘤，撤除GCV藥物后腫瘤生長得到恢復(fù)。(4)發(fā)現(xiàn)Matrigel中的Laminin成分是誘導(dǎo)Nanog陰性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的重要因素。體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)生長因子減少的Matrigel與常規(guī)Matrigel具有相同的促成瘤作用，提示誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)的因素應(yīng)在兩者共同的基質(zhì)成分中;體外分別使用Matrigel的兩種主要基質(zhì)成分Collagen I和Laminin-1作為支撐成分，進(jìn)行Nanog陰性細(xì)胞的逆分化研究，發(fā)現(xiàn)其中

21、Laminin-1可以在體外連續(xù)培養(yǎng)的條件下誘發(fā)陰性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。(5)發(fā)現(xiàn)Erk/STAT3信號通路可能參與Nanog陰性細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)。Western Blot檢測顯示Erk在Nanog陰性細(xì)胞中的磷酸化水平高于陽性細(xì)胞，且陽性細(xì)胞分化后Erk磷酸化水平也上升，而STAT3則表現(xiàn)恰恰相反;Western Blot進(jìn)一步也證明Matrigel和Laminin可誘導(dǎo)Nanog陰性細(xì)胞中的Erk和STAT3的磷酸化狀態(tài)向Nanog陽性細(xì)胞相同的方

22、向轉(zhuǎn)變。
　　綜上所述，本研究的主要結(jié)論是:
　　1.Nanog可以作為肝癌干細(xì)胞的新標(biāo)記物，其可與IGF信號形成正反饋調(diào)節(jié)通路，調(diào)控肝癌干細(xì)胞的自我更新。
　　2.Nanog和CD133能很好的指示和區(qū)分肝癌細(xì)胞的自我更新能力，在以二者為基礎(chǔ)建立的肝癌干細(xì)胞分化模型中，Nanog處在分化層級的較頂端。
　　3.Nanog陰性細(xì)胞在體內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)為陽性細(xì)胞，在體外可以通過添加Matrigel模擬這種轉(zhuǎn)變，而Matr