共載鹽霉素和氯喹的納米脂質(zhì)體體外抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的作用研究.pdf

1、我國是肝癌發(fā)病率較高的國家，目前對其尚缺乏有效的治療手段，因此，迫切需要尋找一種有效的治療方案。而肝癌干細(xì)胞(LCSCs)被認(rèn)為是肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的主要原因，因此消除LCSCs對于肝癌的治療至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素(SAL)對多種腫瘤干細(xì)胞（CSCs，包括LCSCs）具有殺傷作用，而且在體內(nèi)和體外均能抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。因此，本課題首先選用SAL作為殺傷LCSCs的化療藥物。
　　然而，研究表明腫瘤中的普通腫瘤

2、細(xì)胞可以自發(fā)和隨機地變成CSCs，因此，癌癥治療需要同時殺傷CSCs和普通腫瘤細(xì)胞。然而，SAL對普通腫瘤細(xì)胞（包括肝癌細(xì)胞）的殺傷能力較弱，而且，SAL具有較強的神經(jīng)和肌肉毒性。因此，亟需提高SAL對肝癌細(xì)胞的殺傷能力，以期在達(dá)到同樣腫瘤治療效果的前提下，降低SAL的用量和毒性。
　　藥物聯(lián)合治療是指將兩種或多種藥物聯(lián)合使用治療疾病，被認(rèn)為是一種提高化療藥物腫瘤殺傷能力和降低化療藥物毒性的有效方法。自噬是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的分解代

3、謝過程，在腫瘤發(fā)展階段可以促進(jìn)腫瘤存活，因此，抑制自噬可以有效的殺傷腫瘤。而氯喹(CQ)作為一種常用的自噬抑制劑，和多種化療藥物聯(lián)用可顯著增強化療藥物殺傷腫瘤的能力。因此，在本課題中，擬將SAL和CQ進(jìn)行聯(lián)合給藥，以期提高SAL對肝癌細(xì)胞的殺傷能力。
　　在藥物聯(lián)合治療中，藥物相互作用是必須要考慮的問題。兩種藥物聯(lián)用可以產(chǎn)生三種作用，即協(xié)同作用，相加作用和拮抗作用。因此，需要對其進(jìn)行優(yōu)化，得到兩者聯(lián)用的最佳協(xié)同比例。但由于不同藥物

4、具有不同的藥代動力學(xué)特性，因此游離藥物可能無法維持協(xié)同比例到達(dá)腫瘤部位，這就需要通過藥物遞送系統(tǒng)來實現(xiàn)。而研究表明，共遞送系統(tǒng)比單獨的藥物遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出更好的治療效果。更重要的是，有證據(jù)表明，對于癌癥的治療，共遞送兩種藥物會產(chǎn)生協(xié)同作用，而兩個單獨遞藥系統(tǒng)的簡單物理混合物則不會有這種效果。因此，將SAL和CQ以協(xié)同比例共包載于同一納米脂質(zhì)體中，不僅增強了抗腫瘤的效果，而且進(jìn)一步降低了SAL的毒性。
　　第一部分首先采用懸浮球培養(yǎng)方

5、法從HepG2細(xì)胞中分離出具有干細(xì)胞特性的微球體，簡稱為HepG2-TS。然后，分別考察了SAL和CQ對HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的殺傷作用，并得到了各自的IC50值。其中SAL對HepG2細(xì)胞的IC50=5.200±0.719μM，對HepG2-TS的IC50=0.321±0.079μM; CQ對HepG2細(xì)胞的IC50=10.531±1.322μM，對HepG2-TS的IC50=18.687±3.018μM。說明SAL對Hep

6、G2-TS具有更強的殺傷作用。最后，考察了兩者聯(lián)用時在不同濃度和不同比例的條件下，對HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的殺傷作用，從而確定了兩者聯(lián)用的最佳協(xié)同比例，即SAL∶CQ=1∶5(mol/mol)。
　　第二部分建立了SAL和CQ的體外含量測定方法并對其進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，SAL在10～1280μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=1028C-661.1(R2=1)。CQ在5～320.μ

7、g/mL的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=38435C-46890(R2=0.9999)。且所建立的SAL和CQ的體外含量測定方法具有特異性，精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，因此，本課題接下來的實驗均采用該方法作為藥物含量的測定方法。
　　第三部分以氫化大豆卵磷脂(HSPC)、膽固醇和DSPE-PEG2000為材料，摩爾比為85∶10∶5，采用乙醇注入法和硫酸銨梯度法分別制備了空白納米脂質(zhì)體(NL)、載SAL的納

8、米脂質(zhì)體(SNL)、載CQ的納米脂質(zhì)體(CNL)和共包載SAL和CQ的納米脂質(zhì)體(S CNL)。所得納米脂質(zhì)體的粒徑為120 nm左右，分散均勻，形態(tài)圓整，zeta電位為-13.7～-17.1 mV。SNL中SAL的包封率(EE)約為70％，載藥量(DL)約為3％; CNL中CQ的EE約為70％，DL約為10％; SCNL中SAL和CQ的EE和DL與SNL和CNL基本一致，且二者的摩爾比約為1∶5。
　　第四部分對藥物和納米脂質(zhì)體

9、在體外抗HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的活性進(jìn)行了研究。分別采用CCK-8法考察細(xì)胞毒性，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法考察細(xì)胞凋亡的情況，以及克隆形成實驗考察HepG2細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，SAL和CQ以協(xié)同比例聯(lián)用可以顯著提高對HepG2細(xì)胞的殺傷作用，誘導(dǎo)凋亡的能力和抑制增殖的能力，而對于HepG2-TS則沒有明顯的增強作用。另外，SNL和CNL聯(lián)用組及SCNL組在HepG2細(xì)胞中都表現(xiàn)出最強的殺傷作用，誘導(dǎo)凋亡的能

10、力和抑制增殖的能力，而在HepG2-TS中雖然不像在HepG2細(xì)胞中那樣具有明顯的增強作用，但也同樣具有較強的殺傷作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，且這兩者之間抗HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第五部分首先采用Western-Blot考察了HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的基本自噬水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞的基本自噬水平比HepG2-TS高。接著，又考察了不同處理組（即SAL、CQ、SAL+CQ、NL、SN

11、L、CNL、SNL+CNL和SCNL）對HepG2細(xì)胞和HepG2-TS自噬水平的影響，發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中，各處理組都具有較強的誘導(dǎo)自噬水平下降的作用，而在HepG2-TS中則沒有這種作用。這就解釋了第四部分的結(jié)果，即由于HepG2細(xì)胞的基本自噬水平高，而自噬對于肝癌細(xì)胞是一種保護(hù)作用，因此，當(dāng)SAL與自噬抑制劑CQ聯(lián)用后，可以通過抑制HepG2細(xì)胞的自噬水平增強對其抗腫瘤活性，而HepG2-TS由于基本自噬水平較低，所以抑制自噬并