HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞模型的建立.pdf

1、目的乙型肝炎病毒(HBV)宿主范圍窄，動(dòng)物模型缺乏，體外組織培養(yǎng)也一直沒(méi)有多大進(jìn)展，且不能在體外人工培養(yǎng)，制約了對(duì)HBV的研究進(jìn)展。將HBVDNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，建立表達(dá)HBV的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，對(duì)研究HBV生物學(xué)特性和肝炎發(fā)病機(jī)制有重要意義。本研究采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立肝癌細(xì)胞(HepG2)HBV復(fù)制模型，使其分泌HBV，為后續(xù)HBV體外感染研究提供病毒樣顆粒。我室多年從事HBV宮內(nèi)感染研究，并提出了HBV感染胎盤的“細(xì)胞轉(zhuǎn)移”假說(shuō)，但

2、具體的細(xì)胞機(jī)制尚不確切，因此本研究在建立HBV的HepG2細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，以絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞(HPT-9)為靶細(xì)胞建立HBV的細(xì)胞模型，為HBV感染胎盤的機(jī)制研究提供新的手段。 方法1.pcDNA3/3HBV重組質(zhì)粒的構(gòu)建：獲得HBV全基因亞克隆載體pUC19/3HBV和真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3，酶切及測(cè)序鑒定。膠回收3倍HBV基因和線性pcDNA3，然后在T4DNA連接酶作用下4℃連接。連接產(chǎn)物(pcDNA3/3HBV)酶切鑒

3、定。 2.脂質(zhì)體介導(dǎo)下pcDNA3/3HBV基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選：轉(zhuǎn)染前一天將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞和HPT-9細(xì)胞用胰酶消化，并換含10％新生小牛血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種于6孔板使其轉(zhuǎn)染時(shí)密度達(dá)到90％，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。方法按LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行。48h后換含800μg/mlG418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照。待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，用含4

4、00μg/mlG418的培養(yǎng)基維持傳代培養(yǎng)。 3.蛋白表達(dá)的檢測(cè)：(1)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg。(2)免疫組化檢測(cè)細(xì)胞中HBcAg。 4.細(xì)胞中HBVDNA復(fù)制的檢測(cè)：(1)選擇性PCR擴(kuò)增HBVrcDNA和cccDNA：根據(jù)HBVrcDNA與cccDNA結(jié)構(gòu)不同，分別設(shè)計(jì)不同引物，擴(kuò)增rcDNA和cccDNA。(2)HBVmRNA表達(dá)的檢測(cè)：提取轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增S基因mRNA

5、。 5.細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA的檢測(cè)：(1)HBVDNA定性檢測(cè)：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提取DNA，PCR擴(kuò)增整個(gè)S區(qū)基因。(2)HBVDNA定量檢測(cè)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清做熒光定量PCR檢測(cè)HBVDNA滴度。 結(jié)果1.成功構(gòu)建了HBV全基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/3HBV，該質(zhì)粒含有完整的頭尾串聯(lián)的三個(gè)拷貝的HBV全基因。 2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后3wk內(nèi)對(duì)照組HepG2細(xì)胞在G418的作用下全部死亡，同時(shí)

6、轉(zhuǎn)染pcDNA3/3HBV組HepG2細(xì)胞陽(yáng)性克隆形成。細(xì)胞繼續(xù)用G418篩選，傳代培養(yǎng)，建立了攜帶HBV全基因的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg均為陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)有呈漿型分布的HBcAg。細(xì)胞中rcDNA和cccDNA均陽(yáng)性。RT-PCR證實(shí)有HBVS基因mRNA的表達(dá)。上清中HBVS及前S基因陽(yáng)性，熒光定量PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后48h、1mo、3mo轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中HBVDNA滴度達(dá)分別為1×105拷貝/mL、

7、4×104拷貝/mL、7×104拷貝/mL。 3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPT-9細(xì)胞后2wk內(nèi)對(duì)照組HPT-9細(xì)胞在G418的作用逐漸死亡，轉(zhuǎn)染pcDNA3/3HBV組HPT-9細(xì)胞陽(yáng)性克隆形成，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一周后，傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染組HPT-9細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg為陽(yáng)性，但HBeAg為陰性。細(xì)胞內(nèi)HBcAg呈核漿型分布，以漿型分布為主。細(xì)胞中rcDNA和cccDNA均陽(yáng)性。RT-PCR證實(shí)有HBVS基因mRNA的表達(dá)。上清中HBVS及前S基

8、因陽(yáng)性，熒光定量PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后20d、30d轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中HBVDNA滴度達(dá)分別為1.03×103拷貝/mL、2.9×103拷貝/mL。 結(jié)論1.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/3HBV能介導(dǎo)HBVDNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制。 2.pcDNA3/3HBV轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)存在HBVDNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，并有HBcAg的表達(dá)，細(xì)胞能向上清液中分泌HBsAg、HBeAg和HBVDNA。成功建立了攜帶