HBV對(duì)低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤的第五位，死亡率居第三位，而在我國(guó)年發(fā)病率居第三位，年患病率約為10～150/10萬(wàn)人，死于原發(fā)性肝癌的患者約32萬(wàn)人/年。根據(jù)回顧性調(diào)查結(jié)果表明原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，HBV感染引起的慢性乙型肝炎是原發(fā)性肝癌最重要的病因之一。針對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)展迅猛、高侵襲性，血管密度高等特性，臨床上已有針對(duì)血液供應(yīng)的治療策略，如血管栓塞、抗VEGFR生物治療等，但預(yù)后并不理

2、想。針對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖迅速相對(duì)低氧的微環(huán)境，課題組前期研究證明低氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)可上調(diào)HSP70-2表達(dá)從而抵抗凋亡，HepG2與HBV穩(wěn)定復(fù)制的HepG2.215細(xì)胞間熱休克蛋白70-2的表達(dá)存在差異，其機(jī)制尚不清楚。鑒于此，本課題探討了低氧微環(huán)境下，肝癌細(xì)胞HepG2及HBV穩(wěn)定復(fù)制的HepG2.215的增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因survivin、轉(zhuǎn)錄因子HIF-1?及VEGF的表達(dá)變化及機(jī)制，為以其為靶點(diǎn)的干預(yù)研究奠定基礎(chǔ)。<

3、br>　　方法：①細(xì)胞增殖試驗(yàn)：采用CCK-8試劑盒檢測(cè)低氧條件下，L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、24h、48h、72h）OD值，以及通過(guò)細(xì)胞染色等方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖；②細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC和PI雙染色FCM檢測(cè)L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞在1％低氧條件下，0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h的凋亡與壞死；③免疫印跡：采用WesternBlot檢測(cè)1%低氧

4、條件下，不同時(shí)間點(diǎn)（0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h）L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞內(nèi)HIF-1?/VEGF/Survivin的表達(dá)；④miRNA基因芯片及microRNA檢測(cè)：用trizol法提取HepG2細(xì)胞和HepG2.215細(xì)胞的總RNA，用miRNA基因芯片檢測(cè)兩種細(xì)胞中miRNA的表達(dá)差異。對(duì)有表達(dá)差異的miRNA采用生物信息學(xué)方法分析針對(duì)HIF-1?的miRNA表達(dá)的差異；⑤細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)：1×1

5、04L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞放置于transwell小室中的下室，1×103THP-1細(xì)胞置于上室，低氧條件下培養(yǎng)48h，常規(guī)固定及結(jié)晶紫染色檢測(cè)通過(guò)PMA誘導(dǎo)的THP-1分化為巨噬細(xì)胞的趨化；⑥Arg1、Fizz1、iNOS的表達(dá)的檢測(cè)：1×105L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞1%低氧培養(yǎng)48h后，取上清與1×104THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)48h，RT-PCR檢測(cè)PMA誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細(xì)胞后Arg1、

6、Fizz1、iNOS的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧條件下培養(yǎng)72hL02/HepG2/HepG2.215的增殖率均分別高于普通組，提示低氧微環(huán)境有利于L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞的增殖。⑵AnnexinV/PI雙染色FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，在1%低氧條件下培養(yǎng)72h，L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞凋亡率低于普通培養(yǎng)組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果提示低氧并不促進(jìn)細(xì)胞凋亡。⑶WB結(jié)果顯示，He

7、pG2細(xì)胞及HepG2.215細(xì)胞內(nèi)HIF-1?表達(dá)在低氧6h后達(dá)到高峰，并維持在高于正常水平；LO2細(xì)胞HIF-1表達(dá)在低氧48h后達(dá)到高峰，維持在高于正常水平；在各時(shí)間點(diǎn)中，HepG2.215細(xì)胞內(nèi)HIF-1?表達(dá)均顯著高于HepG2細(xì)胞，結(jié)果提示低氧可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞高表達(dá)HIF-1，且HBV穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞其表達(dá)增高更為顯著；3種細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)在低氧12h均達(dá)到高峰，48h有下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組。⑷miRNA基因芯

8、片檢測(cè)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，與HepG2細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)HepG2.215細(xì)胞靶向HIF-1的miRNA（miR-2392，miR-3945，miR-1914-3p，miR-1236-5p和miR-4253）表達(dá)下調(diào)。⑸與普通培養(yǎng)相比，1%低氧環(huán)境下，肝癌細(xì)胞HepG2/HepG2.215培養(yǎng)上清對(duì)PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的趨化能力減弱，但促進(jìn)PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞向M2極化，抑制其向M1極化。
　　

9、結(jié)論：①低氧環(huán)境培養(yǎng)下L02/HepG2/HepG2.215細(xì)胞凋亡率相對(duì)降低，而細(xì)胞增殖率顯著增高，并誘導(dǎo)HIF-1α和survivin高表達(dá)，提示其對(duì)于肝癌細(xì)胞耐受低氧并促進(jìn)其增殖發(fā)揮著重要作用；②低氧環(huán)境培養(yǎng)下HBV穩(wěn)定表達(dá)的HepG2.215細(xì)胞HIF-1α上調(diào)更為顯著，并維持較高水平，可能與HBV穩(wěn)定表達(dá)的肝癌細(xì)胞靶向HIF-1α的miRNA下調(diào)有關(guān)，詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究；③低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清雖然趨化PMA誘導(dǎo)