分化抑制因子ID1在調(diào)控化療誘導(dǎo)的肝癌細胞“干性”改變中的作用研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular cell carcinoma，HCC，簡稱“肝癌”）是最常見的原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率占惡性腫瘤的第5位，死亡率居第3位。早期肝癌治療的主要手段是手術(shù)切除、肝移植和局部消融治療，可使患者獲得超過50％的5年生存率，但僅不足30％的患者有機會接受根治性治療，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期、或在根治術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，需要接受肝動脈栓塞化療(TACE)、索拉非尼或全

2、身化療等姑息治療方法。但無論是接受局部的肝動脈栓塞化療還是系統(tǒng)性的化療，多數(shù)患者仍將面臨因肝癌進展、轉(zhuǎn)移或繼發(fā)耐藥而導(dǎo)致的治療失敗。腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSCs)是近年來腫瘤學(xué)研究的一個熱點。目前認為，CSCs是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細胞特性的細胞群體，它們具有自我更新能力，形成不同分化程度的腫瘤細胞。由于對常規(guī)化療藥物和現(xiàn)有的靶向治療耐藥，造成腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥。雖然對CSCs重要性的認識不斷加深

3、，但是對于其細胞起源仍存在爭議，究竟是源于正常干細胞發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化還是已分化的腫瘤細胞獲得的自我更新能力目前還不清楚。有研究顯示，化療藥物治療后可導(dǎo)致未能清除的殘留肝癌細胞生物學(xué)特性惡化，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）和“干性”（stemness）增強。
　　ID1作為一個癌基因，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。ID1高表達可使腫瘤細胞獲得類似于干細胞的

4、特性，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥。本課題組的前期研究中，運用全基因組芯片篩選并驗證奧沙利鉑治療組和對照組肝癌皮下瘤差異基因，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑治療組裸鼠肝癌皮下瘤組織ID1表達明顯上調(diào)，提示ID1在奧沙利鉑治療后干性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。
　　目的:
　　通過研究ID1在化療誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生“干性”改變中的作用，了解ID1調(diào)控干性改變的可能分子機制，為干預(yù)肝癌耐藥、探索針對肝癌干細胞的靶向治療打下理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　

5、首先建立奧沙利鉑耐藥的肝癌細胞株。選用高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞株MHCC-97H，以梯度濃度2、5、25μmol/L奧沙利鉑序貫培養(yǎng)，使細胞逐步耐受奧沙利鉑并穩(wěn)定生長，最終獲取細胞株并命名為MHCC97H-OXA。CCK8方法檢測其對奧沙利鉑的敏感性，通過檢測CSC相關(guān)分子標(biāo)志以及轉(zhuǎn)移、“干性”功能驗證肝癌耐藥細胞株的“干性”特征。進一步構(gòu)建干擾（ID1-KD）和過表達ID1（ID1-OE）的不MHCC-97H細胞穩(wěn)定株，確定ID1調(diào)控肝

6、癌細胞“干性”的機制。最后用免疫組織化學(xué)染色方法對152例手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌患者的組織芯片進行分析，Kaplan-Meier方法計算總生存期和無復(fù)發(fā)生存期，Log-rank方法比較高表達組和低表達組兩組間的差異。
　　結(jié)果:
　　1.運用CCK8方法檢測肝癌細胞株MHCC-97H和其相應(yīng)的耐藥細胞株MHCC97H-OXA對奧沙利鉑的藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)，驗證了耐藥株的耐藥性(P＜0.0001);但其增殖速度明顯低于

7、野生型株(P＜0.0001)。WB比較MHCC-97H和MHCC97H-OXA細胞中Aurora-A和ID1的表達，發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA中Aurora-A和ID1表達均較野生株升高。通過劃痕實驗分析耐藥細胞株的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA細胞株的遷移明顯增強(P＜0.0001)。進而通過Transwell實驗分析耐藥細胞株的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)MHCC97H-OXA細胞株的侵襲能力顯著增強(P＜0.0001)。為進一步分析奧

8、沙利鉑耐藥株的成瘤能力，我們做了平板克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)盡管耐藥株的增殖變慢，但是其克隆形成能力明顯增強(P=0.0002)。
　　2.通過病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建ID1干擾或過表達的MHCC-97H細胞株，分別命名為ID1-KD和ID1-OE，觀察敲低或過表達ID1對肝癌細胞干性的影響。與對照組相比，ID1敲低后細胞的遷移能力顯著下降(P=0.002);侵襲能力下降(P=0.01);克隆形成能力也顯著下降(P＜0.0001)，對奧沙

9、利鉑的敏感性顯著增強(P＜0.0001)。反之，與對照組相比，ID1過表達的MHCC-97H細胞株(ID1-OE)中，克隆形成能力顯著增強(P=0.0003)，對奧沙利鉑的敏感性顯著下降(P＜0.0001);ID1敲出后，伴有Aurora-A激酶表達下降，而ID1過表達后，Aurora-A激酶的表達同時上調(diào)。
　　3.Aurora-A抑制劑VX-689可遏制ID1誘導(dǎo)的克隆形成能力(P＜0.0001)，顯著增加其對奧沙利鉑的敏感性

10、(P＜0.0001)。而且VX-689500nM作用于MHCC97H-OXA細胞后，可降低Aurora-A激酶活性，表現(xiàn)為p-Aurora A(Thr288)的表達下調(diào)，同時耐藥細胞的遷移能力(P＜0.0001)、侵襲能力(P＜0.0001)、克隆形成能力均明顯受抑(P＜0.0001)，VX-689也逆轉(zhuǎn)了MHCC97H-OXA細胞的耐藥性(P＜0.0001)。
　　4.對152例HCC患者的組織進行免疫組化分析，中位隨訪時間為5

11、1.17±21.46個月。Aurora-A高表達患者58例，低表達94例。低表達組的中位OS尚未達到，高表達組的中位OS為30個月，P＜0.001;低表達組的中位RFS尚未達到，而高表達組的中位RFS為15個月，兩組間比較P值＜0.001。ID1高表達組患者68例，低表達患者84例，低表達組的中位OS尚未達到，高表達組的中位OS為35個月，P＜0.001; ID1低表達組的中位RFS也未達到，而高表達組的中位RFS為23個月，P=0.0

12、013。用Pearson Correlation分析顯示，Aurora-A與ID1兩者相關(guān)系數(shù)=0.285，P＜0.001。多因素分析顯示，Aurora-A和ID1分別是與肝癌患者OS相關(guān)的獨立預(yù)后因素，Aurora-A也是與RFS有關(guān)的獨立預(yù)后因素。Aurora-A和ID1同時高表達組的患者預(yù)后最差，中位OS和RFS較僅Aurora-A或ID1為高表達或同時為低表達/陰性組的中位OS和RFS均明顯縮短，P＜0.001。
　　結(jié)論

13、:
　　1.體外細胞水平研究顯示，耐藥的MHCC97H-OXA細胞株Aurora-A表達升高并伴有干性相關(guān)因子和功能的增強。
　　2.分化抑制因子ID1是調(diào)控肝癌細胞發(fā)生干性表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，干擾ID1表達可以抑制其干性和耐藥。
　　3.ID1可通過Aurora-A的介導(dǎo)促進HCC細胞發(fā)生干性轉(zhuǎn)化。抑制Aurora-A活性可以逆轉(zhuǎn)ID1誘導(dǎo)的干性及耐藥。
　　4.Aurora-A及ID1是與肝癌患者OS有關(guān)的獨

14、立預(yù)后因素，Aurora-A也是與RFS有關(guān)的獨立預(yù)后因素，兩者表達密切相關(guān)。Aurora-A和ID1同時過表達的患者無復(fù)發(fā)生存期和總生存期最短，預(yù)后最差，從臨床上驗證了Aurora-A和ID1間的互相促進關(guān)系，兩者同時過表達的患者更容易復(fù)發(fā)和進展。
　　應(yīng)用價值:
　　1.明確了化療后肝癌細胞的耐藥性與殘余腫瘤細胞的”干性”增強有關(guān)，有助于開發(fā)靶向作用于腫瘤干細胞的藥物以克服傳統(tǒng)化療無法根除腫瘤細胞的不足，降低HCC的轉(zhuǎn)移

15、和復(fù)發(fā)。
　　2.ID1是調(diào)控腫瘤細胞發(fā)生“干性”轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，阻斷ID1有助于逆轉(zhuǎn)HCC的“干性”。ID1是值得進一步探索治療靶點。
　　3.Aurora-A可介導(dǎo)ID1調(diào)控HCC的“干性”轉(zhuǎn)化，抑制Aurora-A激酶可干擾ID11誘導(dǎo)的“干性”改變和耐藥;而阻斷Aurora-A激酶活性可以克服化療后誘導(dǎo)的“干性”。本實驗為Aurora-A抑制劑用于HCC的臨床試驗提供了理論基礎(chǔ)。
　　4.Aurora-A和ID