酸性神經(jīng)酰胺酶在缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞化療耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討酸性神經(jīng)酰胺酶在缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞多藥化療耐藥中的作用及機(jī)制，為闡明肝癌癌細(xì)胞獲得化療耐藥的機(jī)制及尋求克服肝癌化療耐藥新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　（1）采用RT-PCR方法初步檢測(cè)21例肝癌患者肝癌組織、癌旁組織及多種肝癌細(xì)胞株、正常肝細(xì)胞株中ASAH1 mRNA表達(dá)情況，ImageJ軟件掃描灰度半定量法分析表達(dá)情況,初步探討酸性神經(jīng)酰胺酶在肝癌中表達(dá)特點(diǎn)。
　?。?）采用MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Hep

2、G2在不同濃度梯度CoCL2(0、12.5、25、50、100、200、400umol/L)模擬缺氧環(huán)境下細(xì)胞增殖情況，確定HepG2最佳體外缺氧環(huán)境以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　（3）MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞在CoCL2誘導(dǎo)缺氧的條件下及常氧條件下對(duì)阿霉素、順鉑化療藥的敏感性， IC50計(jì)算軟件計(jì)算 IC50值；RT-PCR、Western-Blot法等檢測(cè)缺氧和常氧條件下HepG2細(xì)胞中酸性神經(jīng)酰胺酶及多藥耐藥基因-1表達(dá)水平，初步

3、探討缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的生物學(xué)機(jī)制。
　?。?）采用酸性神經(jīng)酰胺酶抑制劑NOE靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶，MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞在常氧和缺氧環(huán)境下對(duì)化療敏感性改變，RT—PCR、Western-Blot法等檢測(cè)酸性神經(jīng)酰胺酶及多藥耐藥基因-1表達(dá)水平，探究靶向酸性神經(jīng)酰胺酶在逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥中作用及機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　(1)RT-PCR結(jié)果顯示：在21例肝癌患者組織標(biāo)本中，有12例患者肝癌組織中 ASAH1

4、mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織,21例肝癌組織ASAH1mRNA平均表達(dá)水平顯著高于21例癌旁平均水平，半定量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。ASAH1 mRNA表達(dá)在三種肝癌細(xì)胞株中表達(dá)水平明顯高于兩種正常肝細(xì)胞株。
　　(2)CoCL2濃度梯度在12.5、25、50、100umol/L下， HepG2細(xì)胞增殖情況與常氧條件下沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)CoCL2濃度在200、400umol/L條件下，細(xì)胞增殖能力明顯減弱（p<0

5、.05），因而HepG2細(xì)胞在100umol/LCoCL2條件下能夠較好耐受缺氧且增殖能力不受影響。
　?。?）HepG2細(xì)胞在100umol/L CoCL2模擬的缺氧條件下對(duì)阿霉素、順鉑的化療敏感性明顯降低，缺氧條件下對(duì)阿霉素IC50值為2.85umol/L,明顯高于常氧條件下IC50值1.39 umol/L,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺氧條件下對(duì)順鉑IC50值為325.82umol/L,明顯高于常氧條件下IC50值1

6、84.18 umol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PCR、Western-blot結(jié)果顯示酸性神經(jīng)酰胺酶、多藥耐藥基因-1在缺氧8h和24h條件下mRNA、蛋白水平表達(dá)水平高于常氧條件下的表達(dá)水平。
　?。?）NOE靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶能夠增加細(xì)胞在缺氧條件下對(duì)阿霉素、順鉑化療的敏感性，并且明顯下調(diào)常氧和缺氧條件下酸性神經(jīng)酰胺酶、多藥耐藥基因-1 mRNA、蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　（1）酸性神經(jīng)酰

7、胺酶基因在肝癌中表達(dá)升高，可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　?。?）CoCL2濃度為100umol/L時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞可以最大限度的誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧而對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響。
　　（3）100umol/L CoCL2誘導(dǎo)的缺氧條件下 HepG2細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑化療敏感性明顯降低，缺氧誘導(dǎo)酸性神經(jīng)酰胺表達(dá)升高，可能通過(guò)調(diào)控多藥耐藥基因-1的表達(dá)水平繼而使肝癌細(xì)胞獲得化療耐藥。
　?。?）靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶可能通過(guò)下調(diào)多