Cetuximab逆轉缺氧環(huán)境下胃癌細胞化療耐藥性及其機制的研究.pdf

1、1．研究背景 晚期胃癌缺乏有效的治療方法，預后不佳，有必要尋找新的治療手段和藥物。缺氧是促進惡性腫瘤發(fā)展的關鍵因子之一，可誘導腫瘤細胞對化療和放療產(chǎn)生耐受性，促進腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移。HlF-1是調(diào)節(jié)細胞對氧濃度改變的主要因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異二聚體，HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α的活性和表達。HIF-1α可調(diào)控超過60種的下游靶基因，參與到能量代謝、血管生成、細胞的增值等生理活

2、動中，其中包括VEGF。細胞氧濃度、腫瘤的遺傳基因、細胞因子(如EGF等)可調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白表達。細胞因子激活相應的酪氨酸激酶受體后，信號可通過P13-K/AKT和ERK/MAPK信號轉導通路調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白的合成和功能轉化。 EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量為170kDa，EGFR在多種腫瘤中均有高表達，包括胃癌、結腸癌、頭頸癌等，在胃癌中的表達率高達50﹪-74﹪。EGFR與其配體EGF、TGF

3、-a等結合后，可誘導受體二聚體形成，激活多條下游信號傳導通路，對腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲及新生血管形成均有促進作用。EGFR的高表達與腫瘤的預后不良、短期復發(fā)以及放化療敏感性降低等直接相關。 Cetuximab(C225)是一種人鼠嵌合的抗EGFR的IgGl單克隆抗體。Cetuximab可阻止受體與相應配體結合，從而抑制下游ERK/MAPK、P13-K/AKT、Jak/Start、蛋白激酶C等信號轉導途徑。Cetuxim

4、ab在體內(nèi)和體外均可抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的生成，其抑制VEGF生成的機制有可能是通過抑制HlF-1α的表達。同時，Cetuximab與多種化療藥物聯(lián)合均有協(xié)同抗腫瘤作用。Cetuximab已證實在多種腫瘤中有很好的療效，遺憾的是，到目前為止，Cetuximab聯(lián)合化療用于治療胃癌的臨床研究資料非常缺乏?；谝陨涎芯炕A，我們假設，Cetuximab在缺氧環(huán)境下可提高胃癌細胞對化療藥物Oxaliplatin的敏感性，其機制可能

5、是通過抑制EGFR信號傳導，減少HIF-1α的蛋白合成，進而參與抑制VEGF的表達。 2．研究方法 人胃癌細胞株MGC-803，SGC-7901應用不同藥物處理后分別培養(yǎng)于正常氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)下，采用直接細胞計數(shù)法測定細胞生長狀況；MTT法測定Cetuximab、Oxaliplatin、以及兩藥聯(lián)合的細胞毒作用；采用Annexin V-FITC and Propidium Iodide(P1)雙染法通過流式細胞儀檢測細胞

6、調(diào)亡；提取用不同方法處理后的細胞總蛋白，用免疫印跡的方法分析目的蛋白HIF-1α，P13K/Akt信號通路的關鍵酶Akt、p-Akt(Ser473)，MEK/MAPK信號通路的關鍵酶ERK1/2、p-ERK1/2蛋白，以及BAD、p-BAD、BAX的表達情況，應用人抗VEGF單克隆抗體的ELISA試劑盒檢測不同方式處理的細胞分泌的VEGF蛋白濃度。 3．研究結果 3．1 缺氧和Cetuximab對胃癌細胞生長的影響

7、 缺氧環(huán)境下胃癌細胞的生長速度低于正常氧狀態(tài)。Cetuximab對胃癌細胞的生長無明顯抑制作用。Oxaliplatin可抑制胃癌細胞的生長，且在缺氧狀態(tài)下，細胞生長受抑制的作用明顯低于正常氧狀態(tài)。兩藥聯(lián)合應用后，抑制胃癌細胞生長的作用增強，MGC803細胞常氧狀態(tài)4gh、72h抑制率分別增加(10±2.0)﹪、(14.2±3.2)﹪，缺氧狀態(tài)48h、72h抑制率分別增加(24.2±3.0)﹪、(22±4.2)﹪；SGC7901細胞常氧

8、狀態(tài)48h、72h抑制率分別增加(10.9±1.5)﹪、(7.4±2.8)﹪，缺氧狀態(tài)48h、72h抑制率分別增加(22.2±4.0)﹪、(19.5±3.6)﹪，說明Cetuximab可加強Oxaliplatin對胃癌細胞生長的抑制作用，且這種協(xié)同作用在缺氧環(huán)境下表現(xiàn)更為顯著。 3．2 缺氧和Cetuximab對胃癌細胞化療敏感性的影響 正常氧狀態(tài)下，MGC803和SGC-7901細胞株對Oxaliphtin的IC50分

9、別為5.62±0.10μM和4.11±0.79μM，，而在缺氧環(huán)境下，MGCS03和SGC-7901細胞株對Oxaliplatin的IC50分別為19.54±0.13μM和9.75±0.128μM，說明胃癌細胞在缺氧環(huán)境下Oxaliplatin敏感性下降。聯(lián)合Cetuximab后，正常氧狀態(tài)Oxaliplatin的敏感性分別增加了1.52和1.59倍，缺氧環(huán)境敏感性增加了1.73和2.24倍，說明Cctuximab可提高胃癌細胞株MGC

10、S03和SGC．7901的化療敏感性，且在缺氧環(huán)境下，Cetuximab逆轉細胞耐藥的作用更明顯。 3．3 Cetuximab和OxaHplatin在不同氧狀態(tài)下對胃癌細胞調(diào)亡的作用 缺氧本身不增加胃癌細胞的調(diào)亡；Cetuximab單獨應用不能誘導胃癌細胞MGC803和SGC7901產(chǎn)生凋亡。Oxaliplatin在正常氧態(tài)或缺氧狀態(tài)下都可誘導MGCS03和SGC7901細胞產(chǎn)生凋亡，且調(diào)亡產(chǎn)生的比率呈劑量和時間依賴性。

11、缺氧狀態(tài)下Oxaliplatin誘導細胞產(chǎn)生凋亡的作用明顯減弱，而聯(lián)合Cetuximab可明顯增加正常氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)下Oxaliplatin誘導細胞凋亡的作用，而缺氧狀態(tài)下聯(lián)合治療增加的細胞凋亡的百分比要明顯高于正常氧狀態(tài)下增加的細胞凋亡百分比。 3．4 Cetuximab對信號通路的作用 Westem blot分析結果示，MGCS03細胞HIF-1α的表達在缺氧狀態(tài)下明顯增加；Cetuximab可下調(diào)HIF-1α蛋白

12、的表達水平。Oxliplatin對AKT，ERK1/2和p-AKT，P -ERK1/2蛋白水平?jīng)]有影響，Cetuximab無論單用或聯(lián)合Oxaliplatin應用對正常氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)培養(yǎng)的MGC803細胞的p-AKT、p-ERK1/2、p-BAD蛋白水平均有下調(diào)作用，而對AKT、ERK1/2、BAD和BAX的總量影響不大。與單用Cetuximab相比，Cetuximab聯(lián)合Oxaliplmin可以進一步降低p-AKT、p-ERK1/2

13、和p-BAD蛋白的表達，尤其在缺氧狀態(tài)下，幾乎完全抑制p-AKT、p-ERK1/2和p-BAD蛋白的表達。 3．5 Cetuximab和缺氧對MGC803和SGC7901細胞VEGF分泌的影響 缺氧環(huán)境可誘導細胞VEGF的分泌明顯上調(diào)。Cetuximab在正常氧態(tài)和缺氧狀態(tài)均可減少細胞分泌VEGF蛋白，缺氧狀態(tài)下減少VEGF分泌的作用更強。Oxaliplatin對VEGF的分泌也有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。聯(lián)合Ce

14、tuximab與Oxaliplatin作用后，MGC803和SGC7901細胞VEGF蛋白的分泌較單用Cetuximab或Oxaliplatin明顯下調(diào)，尤以缺氧狀態(tài)下調(diào)更為明顯。 4．結論 4.1 缺氧抑制胃癌細胞的增殖和生長，降低胃癌細胞MGCS03和SGC7901對Oxaliplatin的藥物敏感性，誘導耐藥性的產(chǎn)生，抑制促進細胞凋亡的作用，誘導 HIF-1α的過表達。 4.2 Cetuximab 可提高O

15、xaliplatin在胃癌胞MGC803 SGC7901中的抗腫瘤活性，逆轉缺氧狀態(tài)下MGC803和SGC7901細胞對Oxaliplatin產(chǎn)生的耐藥性。 4.3 Cetuximab逆轉缺氧狀態(tài)下細胞產(chǎn)生的耐藥性的分子機制，可能是通過抑制 P13-K/AKT/BAD、ERK/MAPK等的信號轉導通路，進一步抑制HIF-1α的表達。 4.4 Cetuximab聯(lián)合Oxaliplatin可有效的抑制HIF-1α在胃癌細胞M