肝癌腫瘤干細(xì)胞增殖分化特性的初步研究.pdf

1、目的：
　　 通過組織塊培養(yǎng)法獲得原代肝癌細(xì)胞,檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和EPCAM在原代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,通過流式細(xì)胞分選術(shù)獲得CD133+EPCAM+、CD133+、EPCAM+和CD133 EPCAM。等各細(xì)胞亞群并比較其增殖分化能力。為研究肝癌診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.收集10例經(jīng)病理診斷確診的肝細(xì)胞癌標(biāo)本,用組織塊法進(jìn)行肝癌細(xì)胞原代培養(yǎng)。
　　 2.在倒置

2、相差顯微鏡下觀察肝癌細(xì)胞的生長情況。分別運用免疫熒光激光共聚焦法和流式細(xì)胞術(shù)檢測原代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和EPCAM的表達(dá)情況。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)分選CD133+EPCAM+、CD133+、EPCAM+和CD133-EPCAM-等肝癌細(xì)胞亞群。
　　 4.細(xì)胞體外增殖實驗和分化實驗比較CD133+EPCAM+、CD133+、EPCAM+和CD133-EPCAM-各亞群肝癌細(xì)胞的增殖分化能力。

3、r>　　 結(jié)果：
　　 1.10例組織塊法原代培養(yǎng)肝癌細(xì)胞,3例獲得成功,成功率為3/10。
　　 2.倒置相差顯微鏡下觀察,原代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞具有惡性上皮細(xì)胞表型特征。
　　 3.激光共聚焦觀察,肝癌細(xì)胞中存在CD133+EPCAM+細(xì)胞,CD133和EPCAM都恒定的表達(dá)于細(xì)胞膜。3例肝癌細(xì)胞中,CD133+肝癌細(xì)胞百分比分別為(3.20±1.30)％、(2.60±1.14)%、(2.80±0.84)%,差

4、異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.693)。EPCAM+肝癌細(xì)胞百分比分別為(1.60±1.14)%、(1.60±0.89)%、(2.00±1.22)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.804),CD133+EPCAM+肝癌細(xì)胞百分比分別為(1.00±0.71)%、(1.00±0.71)%、(1.20±0.84)%,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.890)。3例肝癌細(xì)胞CD133+、EPCAM+、CD133+EPCAM+平均表達(dá)率分別為(2.87±1.06)

5、%、(1.73±1.03)%、(1.07±0.70)%。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測3例肝癌細(xì)胞:CD133+肝癌細(xì)胞百分比分別為(3.00±0.36)%、(3.20±4.0.74)%、(3.60±0.78)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞O.05),EPCAM+肝癌細(xì)胞百分比分別為(1.63±0.53)%、(2.00±0.25)%、(1.67±0.23)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),CD133+EPCAM+肝癌細(xì)胞百分比分別為

6、(1.11±0.19)%、(1.194±0.14)%和(1.22±0.34)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。3例肝癌細(xì)胞CD133+、EPCAM+、CD133+EPCAM+的平均表達(dá)率分別為(3.27+0.63)%、(1.77+0.36)%、(1.17±0.21)%。
　　 5.流式細(xì)胞分選術(shù)分選CD133+EPCAM+肝癌細(xì)胞純度為(95.16±3.83)%。
　　 6.細(xì)胞增殖實驗生長曲線顯示,CD133+EP

7、CAM+肝癌細(xì)胞亞群在分選后1、3、5、7天表現(xiàn)為持續(xù)生長,與CD133+、EPCAM+、CD133-EPCAM-細(xì)胞亞群相比,CD133+EPCAM+細(xì)胞具有更強(qiáng)的的體外增殖能力,曲線陡直,在3-5天更見顯著,CD133+EPCAM+細(xì)胞亞群倍增時間為(70.49±5.19)h,而CD133+細(xì)胞、EPCAM+和CD133-EPCAM-細(xì)胞亞群的倍增時間分別為(91.724±17)h、(102.14±17.97)h和(98.89±18

8、.64)h,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。分選后第1天,四組細(xì)胞增殖無顯著差異(P＞0.05),第3天,CD133+EPCAM+細(xì)胞亞群和EPCAM+、CD133-EPCAM-細(xì)胞亞群比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),第5天CD133+EPCAM+細(xì)胞亞群與其余三組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).第7天,CD133+EPCAM+細(xì)胞亞群和EPCAM+細(xì)胞亞群比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與其余兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義

9、(P＞0.05).
　　 7.分化實驗,CD133-EPCAM-肝癌細(xì)胞亞群由分選后第1天的98.7%持續(xù)下降到第12天的(1.74±0.5)%,接近分選前百分比。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立肝癌細(xì)胞的組織塊原代培養(yǎng)方法,操作簡單,成功率高。為后續(xù)研究肝癌干細(xì)胞特性奠定基礎(chǔ)。
　　 2.原代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中含有少量表型為CD133+EPCAM+的肝癌細(xì)胞。表達(dá)恒定。
　　 3.通過流式細(xì)胞分