肝癌細(xì)胞中β-catenin調(diào)控下游靶基因CCN1-Cyr61的研究.pdf

1、目的:
　　 Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常和腫瘤發(fā)生,如該通路的核心分子β-catenin異常表達(dá)與肝癌發(fā)生有關(guān)。富含半胱氨酸61(cysteine rich61,Cyr61/CCN1)是一種細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白,可發(fā)揮多種生理功能,包括介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的形成、細(xì)胞增殖、分化和黏附、促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管形成。肝癌組織和細(xì)胞中Cyr61的異常表達(dá)與β-catenin的異常激活呈正相關(guān)。本研究首先檢測了

2、Cyr61在人類腫瘤組織中的表達(dá)情況,進(jìn)而以肝癌細(xì)胞株HepG2為模型,研究過表達(dá)外源性β-catenin和RNA干擾抑制內(nèi)源性β-catenin表達(dá)時(shí)及dnTcf4抑制β-catenin/Tcf4復(fù)合物轉(zhuǎn)錄活性,對(duì)Cyr61表達(dá)的影響;CHIP實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因檢測研究β-catenin對(duì)Cyr61的直接調(diào)控作用。通過研究為探討肝癌發(fā)生中β-catenin是否調(diào)控了Cyr61表達(dá),為進(jìn)一步揭示Cyr61在肝癌發(fā)生中的作用和機(jī)制奠定

3、基礎(chǔ),為腫瘤診斷與治療提供新的腫瘤標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.采用HE染色、免疫組化的方法檢測人體多系統(tǒng)腫瘤組織芯片和30例腫瘤組織標(biāo)本(包括食道癌、胃癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌組織標(biāo)本各5例)中Cyr61蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.重組腺病毒Adβ-catenin感染肝癌細(xì)胞株HepG2,獲得過表達(dá)外源性β-catenin的HepG2細(xì)胞模型并觀察對(duì)Cyr61表達(dá)的影響。
　　

4、3.HepG2細(xì)胞中以siRNA技術(shù)沉默編碼β-catenin的基因CTNNB1,RT-PCR和Western-blot方法檢測Cyr61表達(dá)的變化。
　　 4.dnTcf4失活策略抑制HepG2細(xì)胞中β-catenin/Tcf4復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性,觀察對(duì)Cyr61表達(dá)的影響。
　　 5.CHIP實(shí)驗(yàn)研究β-catenin對(duì)Cyr61的直接調(diào)控作用。
　　 6.擴(kuò)增Cyr61啟動(dòng)子中包含TBE位點(diǎn)的片段,構(gòu)建熒光素

5、酶報(bào)告基因重組體pGL3-TBE。
　　 7.腺病毒Adβ-catenin和AdGFP聯(lián)合重組體pGL3-TBE,通過熒光素酶報(bào)告基因檢測研究β-catenin對(duì)Cyr61啟動(dòng)子的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織芯片中77％(38/48)的腫瘤組織Cyr61表達(dá)陽性,93％(28/30)腫瘤組織標(biāo)本中Cyr61表達(dá)陽性,神經(jīng)、食管和甲狀腺等的腫瘤組織中表達(dá)強(qiáng)陽性,胃、肝、結(jié)腸、直腸、肺、腎、子宮、皮膚、卵

6、巢、乳腺癌等腫瘤組織中呈陽性表達(dá),膀胱、前列腺和胰腺癌等腫瘤組織中表達(dá)弱陽性。
　　 2.Adβ-catenin感染的HepG2細(xì)胞與AdGFP感染的HepG2細(xì)胞相比,感染48h后,隨著β-catenin的表達(dá)增強(qiáng),Cyr61表達(dá)也隨之增強(qiáng)。
　　 3.Adsi-β-catenin感染的HepG2細(xì)胞與AdSES-hus感染的HepG2細(xì)胞相比較,感染48h后,隨著β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),Cyr61

7、的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)。
　　 4.AddnTcf4感染的HepG2細(xì)胞與AdGFP感染的HepG2細(xì)胞相比,在感染30h后,β-catenin/Tcf4復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性受到明顯抑制,在感染48h后,Cyr61蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 5.CHIP實(shí)驗(yàn)顯示:HepG2細(xì)胞中β-catenin信號(hào)通路可以直接和Cyr61啟動(dòng)子結(jié)合。
　　 6.熒光素酶報(bào)告基因檢測表明β-catenin信號(hào)通路可以對(duì)Cyr6