CCN1-Cyr61在肝硬化-肝癌進(jìn)程中的作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)是肝纖維化過程中成纖維細(xì)胞的主要來源,肝星狀細(xì)胞被激活而轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞并分泌細(xì)胞外基質(zhì)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié);另外,活化的肝星狀細(xì)胞可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移和活力,而肝癌細(xì)胞反過來也可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移、分泌纖維化因子及增強促血管生成的活性,二者相互作用的惡性循環(huán),促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。CCN1即富半胱氨酸61(cysteinerich6

2、1,Cyr61),是CCN家族成員之一,是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子,通過作用于成纖維細(xì)胞,在皮膚創(chuàng)傷-愈合過程中起重要作用。肝臟疾病中,CCN1促進(jìn)了非酒精脂肪性肝炎中巨噬細(xì)胞的浸潤和肝癌細(xì)胞的增殖與遷移,在癌周肝硬化和良性肝硬化組織中CCN1呈高表達(dá),而肝星狀細(xì)胞膜上高表達(dá)CCN1的受體—整合素,提示CCN1可以作用于肝星狀細(xì)胞,但作用機制尚不清楚。本研究通過建立肝纖維化動物模型,并結(jié)合細(xì)胞共培養(yǎng)和裸鼠皮下瘤等實驗,證明如下假設(shè):

3、CCN1在肝纖維化-肝硬化發(fā)展進(jìn)程中呈動態(tài)表達(dá),其表達(dá)水平與肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程相關(guān);CCN1參與促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化;肝纖維化-肝硬化-肝癌進(jìn)程中高表達(dá)的CCN1增強了肝星狀細(xì)胞的促癌作用,最終揭示CCN1在肝硬化-肝癌發(fā)生進(jìn)程中的作用和機制。
　　方法:
　　1.CCN1在肝纖維化-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)程中表達(dá)的研究
　　1.1.檢測分析人肝硬化病例組織標(biāo)本中CCN1蛋白的表達(dá)及定位。
　　1.1.1.應(yīng)用免疫組

4、化染色法檢測32例良性肝硬化組織、30例癌周肝硬化組織和5例正常成人肝臟組織CCN1蛋白的表達(dá)情況。
　　1.1.2.應(yīng)用免疫熒光染色法(CCN1和α-SMA雙標(biāo))檢測肝硬化病例組織標(biāo)本中CCN1蛋白的表達(dá)定位情況。
　　1.2.肝纖維化動物模型中動態(tài)觀察CCN1蛋白在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程的表達(dá)規(guī)律及定位情況。
　　1.2.1.四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)法制作肝纖維化小鼠模型,在制作過程中應(yīng)用HE染色、SIRIUSRE

5、D染色、免疫組織化學(xué)染色和Western-blot等方法,動態(tài)觀察肝臟病變程度、膠原纖維生成情況及肝組織中CCN1蛋白的表達(dá)情況。
　　1.2.2.肝纖維化小鼠模型成型后停止注射四氯化碳,應(yīng)用HE染色、SIRIUSRED染色、免疫組織化學(xué)染色和Western-blot等方法,觀察肝纖維化病情變化與CCN1蛋白表達(dá)變化情況。
　　1.2.3.免疫熒光染色法(CCN1和α-SMA雙標(biāo)),分析CCN1蛋白的表達(dá)定位情況。1.3We

6、stern-blot檢測人和大鼠肝星狀細(xì)胞株中CCN1蛋白的表達(dá)情況。
　　2.CCN1在體外促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化作用的研究
　　2.1.以HEK293細(xì)胞擴增重組腺病毒AdCCN1和AdRFP,體外檢測病毒感染滴度。
　　2.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情
　　況,Western-blot檢測肝星狀細(xì)胞中CCN1表達(dá)情況,應(yīng)用MTT方法檢測肝星狀細(xì)胞的增殖能力,We

7、stern-blot方法檢測肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)情況。
　　2.3.CCN1通過整合素αv調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化的研究。分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞,12小時后加入整合素αv的抗體,應(yīng)用MTT方法檢測肝星狀細(xì)胞的增殖能力,Western-blot檢測肝星狀細(xì)胞中CCN1、α-SMA蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)情況。
　　3.CCN1增強肝星狀細(xì)胞促癌作用的研究
　　3.1.CCN1增強肝星狀細(xì)胞促

8、進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖作用的研究。
　　3.1.1.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細(xì)胞HepG2,并應(yīng)用MTT方法檢測HepG2細(xì)胞的增殖能力。
　　3.1.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞Lx-2,并與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng),5天后將HepG2細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色,觀察其克隆形成的情況。
　　3.1.3.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞Lx-2,

9、收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細(xì)胞HepG2,Western-blot檢測HepG2細(xì)胞中腫瘤相關(guān)信號分子的表達(dá)情況。
　　3.2.CCN1增強肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲作用的研究。
　　3.2.1.分別用AdCCN1或AdRFP肝星狀細(xì)胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細(xì)胞HepG2,應(yīng)用劃痕-愈合實驗、Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗檢測HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　　3

10、.2.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細(xì)胞HepG2,Western-blot檢測HepG2細(xì)胞中侵襲相關(guān)信號分子的表達(dá)情況。
　　3.3.體內(nèi)研究CCN1增強肝星狀細(xì)胞的促癌作用。
　　3.3.1.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細(xì)胞LX-2,得到LX-2-CCN1和LX-2-RFP細(xì)胞,分別將HepG2、LX-2、HepG2+LX-2、HepG2+LX-2

11、-RFP和HepG2+LX-2-CCN1五組細(xì)胞注入裸鼠皮下。
　　3.3.2.動態(tài)檢測各組皮下瘤生長情況,26天后處死裸鼠收集皮下瘤,制作石蠟切片,并提取皮下瘤組織總蛋白。
　　3.3.3.皮下瘤石蠟切片進(jìn)行HE染色,觀察組織形態(tài)。
　　3.3.4.皮下瘤石蠟切片進(jìn)行SIRIUSRED染色,觀察瘤組織中膠原纖維生成的情況。3.3.5.皮下瘤石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色,檢測瘤組織中Ki67表達(dá)情況。
　　3.3.6

12、.皮下瘤石蠟切片進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色—CD31,檢測瘤組織中微血管的生成情況,Western-blot檢測皮下瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.臨床病例檢測發(fā)現(xiàn),肝硬化和肝癌癌周肝硬化組織中CCN1呈高表達(dá),主要表達(dá)于肝實質(zhì)細(xì)胞中,間質(zhì)散在表達(dá),正常成人肝臟組織不表達(dá)CCN1,病例組織中活化的肝星狀細(xì)胞中未檢測到CCN1表達(dá)。
　　2.肝纖維化動物模型中發(fā)現(xiàn),肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中CCN1表達(dá)增高,

13、并隨病情發(fā)展呈動態(tài)變化:CCL4持續(xù)作用——病情持續(xù)加重——CCN1逐漸升高;停止CCL4作用—病情持續(xù)減輕—CCN1持續(xù)降低,而肝纖維化小鼠肝臟中活化的肝星狀細(xì)胞中檢測到CCN1表達(dá)。
　　3.體外檢測發(fā)現(xiàn),人肝星狀細(xì)胞株LX-2中不表達(dá)CCN1蛋白,而大鼠肝星狀細(xì)胞株T6中CCN1呈弱表達(dá),與臨床標(biāo)本和動物模型的研究結(jié)果一致。
　　4.CCN1促進(jìn)了肝星狀細(xì)胞LX-2和T6的增殖能力,并且上調(diào)了兩種細(xì)胞CollagenⅠ

14、及α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　5.阻斷LX-2細(xì)胞膜上的整合素αv,抑制了CCN1促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖和表達(dá)CollagenⅠ及α-SMA蛋白的能力。
　　6.體外研究結(jié)果顯示,CCN1作用于肝星狀細(xì)胞LX-2,增強了其促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的作用,并使HepG2細(xì)胞中β-catenin信號通路的活性增強,并使下游基因cyclineD1、c-myc、survivin及CD34等癌基因或腫瘤相關(guān)因子表達(dá)增高。
　　7

15、.體外研究結(jié)果顯示,CCN1作用于肝星狀細(xì)胞LX-2,增強了其促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2遷移及侵襲的作用,并使HepG2細(xì)胞中侵襲相關(guān)信號通路活性蛋白p-ERK1/2和下游效應(yīng)蛋白MMP-9表達(dá)增高,同時細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)降低。
　　8.裸鼠皮下瘤實驗結(jié)果顯示,LX-2細(xì)胞單獨注入裸鼠皮下后不能形成皮下瘤,而其余四組細(xì)胞注入裸鼠皮下后均形成皮下瘤,其中HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤生長最快。
　

16、　9.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,瘤細(xì)胞排列較混亂,纖維結(jié)締組織大量增生,細(xì)胞呈多形性,組織間有炎細(xì)胞浸潤。
　　10.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織中膠原纖維生成的量較多,同時其Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量較多及染色程度較強。
　　11.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織中微血管的數(shù)量最多;Western-blot結(jié)果顯示,HepG2+L

17、X-2-CCN1組的皮下瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)量最高。
　　結(jié)論:
　　1.臨床病例檢測發(fā)現(xiàn),良性肝硬化和肝癌癌周肝硬化組織中,CCN1在肝實質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá);而在鼠肝纖維化模型,CCN1隨肝纖維化發(fā)展過程呈動態(tài)變化,提示CCN1可能在肝纖維化-肝硬化發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。
　　人和鼠肝星狀細(xì)胞中CCN1的表達(dá)情況表明,CCN1在人和鼠肝纖維化疾病病理過程中的作用機制可能有所不同。
　　2.過表達(dá)CCN1促進(jìn)了

18、肝星狀細(xì)胞株LX-2和T6的增殖,并且上調(diào)了兩種細(xì)胞中collagenⅠ及α-SMA蛋白的表達(dá),提示肝纖維化-肝癌進(jìn)程中,高表達(dá)的CCN1可以參與肝星狀細(xì)胞的活化;阻斷LX-2細(xì)胞膜上的整合素αv可以抑制CCN1促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化的作用,表明CCN1通過與受體整合素αv結(jié)合而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化。
　　3.CCN1作用于肝星狀細(xì)胞LX-2,增強了LX-2細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖、遷移及侵襲的能力,同時提高了其促進(jìn)HepG2細(xì)胞