新肝癌相關(guān)基因HTA功能的初步研究.pdf

1、目的：肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后差的惡性腫瘤，其發(fā)病機制涉及多基因調(diào)控、多信號通路參與，是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，其根源是基因表達(dá)異常。肝癌的傳統(tǒng)治療效果不理想，免疫治療和基因治療現(xiàn)已成為研究熱點，在肝癌中異常表達(dá)的基因是其理論基礎(chǔ)的核心。發(fā)現(xiàn)和研究新的具有應(yīng)用前景的腫瘤相關(guān)基因仍是腫瘤研究的重要領(lǐng)域和難題。聚焦于肝癌相關(guān)基因的研究有望為肝癌的早期診斷、分子免疫治療及預(yù)后分析

2、提供有力的工具。對肝癌相關(guān)基因功能機制的深入研究不僅能豐富肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制和理論體系，更重要的是為肝癌的臨床診斷和治療提供有力的標(biāo)志物和靶點。HTA基因是本實驗室通過生物信息學(xué)方法篩選得到的新肝癌相關(guān)基因，前期實驗結(jié)果表明HTA基因不僅是一種特異性較強的腫瘤標(biāo)志物，而且在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，故有望將其應(yīng)用于肝癌的診斷和免疫治療。同時，正因為HTA基因是從EST文庫中新篩選發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)基因，前期研究只對其表達(dá)的特異性和促癌

3、作用有了初步認(rèn)識，但是關(guān)于該基因結(jié)構(gòu)和功能機制方面的研究尚未開展，因此，本課題擬通過RACE和Northern blot等方法克隆HTA基因的全長并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，對HTA基因編碼的蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化并制備單抗，用過表達(dá)手段研究HTA基因在肝癌細(xì)胞系的中的功能，并結(jié)合基因芯片、酵母雙雜交、western blot等多種細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、實驗動物學(xué)等研究手段和策略深入探討HTA基因在肝癌中的作用機制。
　　方法：

4、⑴RACE PCR擴增HTA基因的全長并對其基因結(jié)構(gòu)、可變剪接進(jìn)行分析，對其編碼蛋白的特點進(jìn)行預(yù)測。Northern blot檢測HTA不同轉(zhuǎn)錄本在肝癌細(xì)胞系及正常細(xì)胞系中的表達(dá)。⑵構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)GST-HTA融合蛋白，用GST瓊脂糖凝膠對融合蛋白進(jìn)行純化并用凝血酶切除GST標(biāo)簽，獲得具有生物活性的HTA蛋白。以HTA蛋白為抗原，用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體并鑒定。以該抗體用于western blot、免

5、疫細(xì)胞化學(xué)檢測HTA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，并初步研究HTA抗體抑制肝癌細(xì)胞系增殖的生物學(xué)功能。⑶構(gòu)建HTA真核表達(dá)載體，在肝癌細(xì)胞系HepG2及HTA表達(dá)量較弱的肝癌宿主肝細(xì)胞系QSG-7701中穩(wěn)定過表達(dá)HTA基因，通過細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞周期檢測、克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗等體內(nèi)外實驗檢測HTA基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞系生物學(xué)表型的影響。⑷以干擾HTA基因前后的HepG2細(xì)胞系總RNA為材料，全基因組表達(dá)譜芯片雜交篩選HTA相關(guān)差異基因。生

6、物信息學(xué)GO分析和pathway分析HTA的相關(guān)差異基因及信號通路，實時熒光定量PCR和western blot檢測感興趣的HTA相關(guān)差異基因，明膠酶譜實驗、細(xì)胞粘附實驗、侵襲轉(zhuǎn)移實驗等進(jìn)一步驗證HTA基因的生物學(xué)功能。⑸以HTA蛋白為誘餌，在標(biāo)準(zhǔn)化人cDNA文庫中，用酵母雙雜交方法篩選HTA的相互作用蛋白。結(jié)合生物信息學(xué)對篩選出來的HTA相互作用蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析及其與HTA蛋白結(jié)合位點契合度分析，挑選感興趣的相互作用蛋白，進(jìn)一步用

7、特異性雙雜交、免疫熒光實驗檢測兩者在細(xì)胞中的定位情況。
　　結(jié)果：①RACE PCR擴增得到HTA基因1414bp的全長序列。進(jìn)一步分析HTA編碼蛋白閱讀框含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，而經(jīng)HTA基因全長驗證，第二號內(nèi)含子存在可變剪切。Northern blot結(jié)果顯示HTA基因在肝癌細(xì)胞系HepG2、QGY-7703中表達(dá)，而在正常細(xì)胞系HUVEC和正常肝細(xì)胞系L-02中均不表達(dá)。檢測到的HTA轉(zhuǎn)錄本和全長擴增所得序列長度一致。②

8、經(jīng)原核表達(dá)、純化得到了36kD大小的GST-HTA融合蛋白。凝血酶去除GST標(biāo)簽后得到了10kD左右的HTA蛋白。以此為抗原制備了HTA單克隆抗體并純化，經(jīng)檢測該抗體(1mg/ml)效價為1∶10000，可用于western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測肝癌細(xì)胞系中HTA的表達(dá)。且HTA抗體對肝癌細(xì)胞系生長有抑制作用。③過表達(dá)HTA的肝癌細(xì)胞系生長增殖速度加快，克隆形成能力增強。細(xì)胞周期進(jìn)程加快，在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力增強，在裸鼠皮下形成的

9、腫瘤中，過表達(dá)HTA細(xì)胞系腫瘤組織中HTA的表達(dá)量較高，且形成的腫瘤惡性程度較高。④干擾HTA前后的肝癌細(xì)胞系HepG2中，多個與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了變化，其功能涉及生長、增殖、代謝等多個功能領(lǐng)域，經(jīng)qPCR和western blot驗證，HTA的差異表達(dá)引起了一些金屬蛋白酶類基因家族成員的表達(dá)變化，ADAM9、ADAM12、ADAM10、ADAM17、MMP9、MMP2等多個因子的表達(dá)與HTA的表達(dá)量同步變化。明膠酶譜實驗

10、檢測到MMP2和MMP9的活性在干擾HTA基因之后明顯下降。細(xì)胞粘附、侵襲、遷移實驗結(jié)果顯示HTA基因能夠增強肝癌細(xì)胞粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。⑤酵母雙雜交篩選出一批可能與HTA相互作用的蛋白。在蛋白結(jié)構(gòu)位點分析基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性雙雜交及細(xì)胞免疫熒光實驗，結(jié)果顯示HTA蛋白能與LRP1相互作用，且二者共定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)。
　　結(jié)論：⑴克隆了新肝癌相關(guān)基因HTA的全長并通過Northern blot驗證。⑵得到了具有生物學(xué)活性的HTA蛋