新基因URG4在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、【背景】
　　肝細(xì)胞肝癌（HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害國(guó)人的健康。我國(guó)肝癌的主要病因?yàn)橐倚透窝撞《荆℉BV）的長(zhǎng)期慢性感染，并且HBVX開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBx具有轉(zhuǎn)錄激活子功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞中許多與細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)的基因的表達(dá)；HBx能調(diào)節(jié)胞漿中的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；HBx能影響DNA修復(fù)。但上述這些機(jī)制只能部分解釋HBx在HBV誘導(dǎo)肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2、。HBx發(fā)揮作用的機(jī)制還存在許多不明之處。為了進(jìn)一步尋找HBx發(fā)揮作用的其它分子，我們課題組運(yùn)用抑制消減雜交及全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增技術(shù)（RACE-PCR）克隆出了一個(gè)可以被HBx蛋白上調(diào)新基因URG4（Upregulatedgene4），該基因全長(zhǎng)3607bp，編碼104KD的蛋白。經(jīng)NIH人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較，此基因定位在人類7號(hào)染色體，無(wú)同源基因。蛋白質(zhì)綜合信息庫(kù)分析（SWISSPROT），此蛋白具有一個(gè)穿膜螺旋（Transmembran

3、e helices:336-353）；三個(gè)核內(nèi)信號(hào)定位肽(Nuclear localization signals:PYRGKRN380、PRPRDKR821、PRDKRQL823)；一個(gè)ATP/GTP結(jié)合區(qū)（ATP/GTP binding site690-697 GVPGTGKS），與caspase修復(fù)成員6（caspase recruitment domain family6）在88-461氨基酸之間有34％同源。初步研究發(fā)現(xiàn)此基因

4、不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性，為又一新的促癌基因。但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還不清楚。
　　【目的】
　　1、檢測(cè)URG4在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義。
　　2、探討URG4與HBx在肝癌組織及細(xì)胞中表達(dá)之間的關(guān)系。
　　3、檢測(cè)URG4對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　【方法】
　　1、免疫組化方法檢測(cè)URG4和HBx在正常組織、肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)分布，并

5、分析其表達(dá)的意義及表達(dá)之間的相關(guān)性。
　　2、RT-PCR和Westernblot檢測(cè)肝癌細(xì)胞系（HHCC、HepG2和SMMC-7721）、永生化肝細(xì)胞QZG及轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞中URG4的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　3、脂質(zhì)體法將URG4基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入QZG細(xì)胞，將URG4特異SiRNA載體轉(zhuǎn)染入肝癌HepG2細(xì)胞中，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的單集落。
　　4、MTT法繪制轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

6、
　　5、流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。
　　6、平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的集落形成能力。
　　7、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)URG4表達(dá)抑制后，肝癌細(xì)胞的體外成瘤能力的變化。
　　8、Westernblot和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclinD1的變化。
　　【結(jié)果】
　　1、URG4在肝癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)
　　100例肝癌

7、標(biāo)本中，48例URG4陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為48％；癌旁組織中URG4陽(yáng)性表達(dá)54例（54％），并且URG4主要表達(dá)在肝硬化組織中；在27例正常組織中，僅6例弱表達(dá)URG4，陽(yáng)性率22.2％。同時(shí)在肝癌細(xì)胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可檢測(cè)到不同程度的URG4mRNA及蛋白的表達(dá)，以HepG2細(xì)胞中表達(dá)最高，但在永生化肝細(xì)胞QZG中沒(méi)有檢測(cè)到URG4的表達(dá)。URG4在肝癌和癌旁肝硬化組織中的表達(dá)高于正常組織，在肝癌細(xì)胞系

8、中的表達(dá)也高于永生化細(xì)胞。
　　2、HBx在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)及其與URG4表達(dá)的關(guān)系
　　肝癌細(xì)胞中HBx幾乎全部表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，偶見部分核染色。78例乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本中，60例HBx陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為76.9％；癌旁組織中HBx陽(yáng)性表達(dá)65例（83.3％），并且HBx也主要表達(dá)在肝硬化組織中；在27例正常組織中，沒(méi)有檢測(cè)到HBx的表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HBx和URG4表達(dá)的相關(guān)系數(shù)0.38（P<0.

9、05），并且在肝癌癌旁組織中的相關(guān)系數(shù)0.45（P<0.05）。HBx基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，URG4mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。
　　3、URG4對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　將URG4正義載體轉(zhuǎn)染入QZG細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)QZG細(xì)胞生長(zhǎng)加快，由G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加；將URG4-siRNA轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞HepG2后，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著減慢，錨定非依賴性生長(zhǎng)的能力、單細(xì)胞集落形成能力以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力均顯著減