TRAIL慢病毒載體構(gòu)建及其在肝癌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建攜帶TRAIL基因的慢病毒表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞株HepG2中的穩(wěn)定高表達(dá),檢測(cè)其對(duì)HepG2的增殖影響,觀察TRAIL高表達(dá)的HepG2在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。
　　 方法:
　　 1.利用PCR和雙酶切法構(gòu)建TRAIL重組慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro;
　　 2.脂質(zhì)體法將重組慢病毒載體和包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病

2、毒顆粒,純化并測(cè)定病毒滴度;
　　 3.利用Westernblotting檢測(cè)慢病毒感染HepG2后TRAIL蛋白的表達(dá)
　　 4.利用MTT檢測(cè)HepG2細(xì)胞的增殖
　　 5.利用裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)HepG2細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。
　　 結(jié)果:
　　 酶切以及測(cè)序證實(shí),成功構(gòu)建攜帶TRAIL基因慢病毒載體,純化的慢病毒滴度為1.02×104ifμ/μL,并發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI=8時(shí),重組慢病毒體外轉(zhuǎn)

3、染效率高。利用嘌呤霉素篩選以及單克隆化后,獲得穩(wěn)定表達(dá)TRAIL的細(xì)胞系,經(jīng)Westernblotting方法檢測(cè)到TRAIL蛋白的穩(wěn)定高表達(dá)。采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRAIL蛋白的HepG2細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響明顯低于HepG2和HepG2-con組(P＜0.05)。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HepG2-TRAIL-1的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建了帶有TRA