SMAC基因干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、白內(nèi)障是世界范圍主要的致盲眼病，據(jù)預(yù)測(cè)到2020年每年會(huì)有2000-2500萬(wàn)患者需行白內(nèi)障手術(shù)。這無疑會(huì)對(duì)社會(huì)和國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探求白內(nèi)障的發(fā)病因素及發(fā)病機(jī)理，延緩和阻止白內(nèi)障發(fā)生及發(fā)展顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者尤其是眼科工作者為此做出了巨大的努力，并取得了令人矚目的成績(jī)。近年來越來越多的證據(jù)表明晶狀體上皮細(xì)胞(Lensepithelialcells，LECs)凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。因此，檢測(cè)

2、年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子機(jī)制，抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡過程，為延緩和阻止年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展提供了新的思路。
　　線粒體蛋白Smac/DIABLO(secondmitochondrialactivatorofcaspase/directIAPbindingproteinwithlowPI)，被稱為第二線粒體來源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑，是一種存在于線粒體并且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。既往研究顯

3、示在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中Smac可能參與了晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡過程以及白內(nèi)障的形成。因此，如果能特異性沉默Smac基因，觀察其下調(diào)前后晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)凋亡的變化，對(duì)白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。
　　RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指在生物體內(nèi)，內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(double.strandedRNA，dsRNA)引起與其同源的mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默。dsRNA經(jīng)酶切后會(huì)形成

4、很多小片段siRNA(SmallinterferingRNA，siRNA)，這些小片段siRNA是一種小RNA分子，一旦與信使RNA(mRNA)中的互補(bǔ)序列互相結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致整條mRNA失去翻譯成蛋白質(zhì)的功能，RNA干擾技術(shù)是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，能夠高效、特異的使靶基因沉默。本實(shí)驗(yàn)擬使用RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)Smac基因的特異性沉默，為進(jìn)一步探索凋亡與白內(nèi)障形成之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　構(gòu)建針對(duì)Smac基因帶有篩

5、選標(biāo)記的siRNA慢病毒載體并測(cè)定目的基因在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，為利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)探討白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.永生化人晶狀體上皮細(xì)胞(HLE-B3)的培養(yǎng):將凍存的晶狀體上皮細(xì)胞復(fù)蘇后，放入含有20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取融合至90％的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.構(gòu)建針對(duì)Smac的慢病毒載體，用于病毒的生產(chǎn)。

6、r>　　3.設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA組，進(jìn)行相應(yīng)病毒感染，病毒感染細(xì)胞16h后換液，并在72h后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)。
　　4.慢病毒感染細(xì)胞96h后提取細(xì)胞中的總RNA，做三次重復(fù)的實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timePCR)。實(shí)驗(yàn)中我們采用家族管理基因GAPDH作為內(nèi)參基因。
　　結(jié)果：
　　(1)綠色熒

7、光蛋白(GFP)在人晶狀體上皮細(xì)胞中成功表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察，熒光表達(dá)明亮均勻，無明顯細(xì)胞毒性，對(duì)感染72小時(shí)后的細(xì)胞照相，發(fā)現(xiàn)每一組的感染率都在80％左右。
　　(2)RT-PCR檢測(cè)Smac基因mRNA水平在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)siRNA組mRNA的量與陰性對(duì)照組比較顯著下調(diào)，敲減效率達(dá)66.5％。(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了慢病毒載體結(jié)構(gòu)來表達(dá)siRNA以達(dá)到對(duì)Smac基因的沉默，為