RNA干擾STUB1基因?qū)θ司铙w上皮細胞增殖及分子伴侶表達的影響.pdf

1、蛋白質(zhì)變性沉積是白內(nèi)障發(fā)生的重要的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)。分子伴侶和泛素-蛋白酶體(UPP)通路是真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的核心機制。分子伴侶，主要由熱休克蛋白組成，對細胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)進行重新折疊和修復；UPP通路則將修復失敗的有害蛋白質(zhì)降解清除。二者相輔相成，共同降低細胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)的濃度，維持細胞的正常生理功能。年齡相關(guān)性白內(nèi)障和其他年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生都與二者的功能下降密切相關(guān)。
　　 STUB1蛋白(又稱CHIP蛋白)是一種同時

2、具有E3泛素連接酶活性和輔助分子伴侶活性的胞漿蛋白，它將分子伴侶和UPP通路兩條蛋白質(zhì)質(zhì)量控制途徑聯(lián)系起來，對變性/有害蛋白質(zhì)的命運起著關(guān)鍵的決定作用。STUB1是一種氨基酸序列高度保守的胞漿蛋白，在心肌、骨骼肌和腦等高代謝組織中高表達，在晶狀體中也有表達。很多研究已證實STUB1蛋白與多種神經(jīng)變性疾病及蛋白質(zhì)沉積疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。但目前對STUB1蛋白在晶狀體內(nèi)作用的研究很少。
　　 為了探討STUB1蛋白在人晶狀體上皮細

3、胞(HLEC)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中的作用，以及這些蛋白質(zhì)間的相互作用，從而為研究白內(nèi)障發(fā)生的分子機制提供實驗依據(jù)。我們構(gòu)建了針對人STUB1基因的ShRNA干擾慢病毒載體，觀察干擾STUB1基因后HLEC生長狀態(tài)的變化及分子伴侶HSP70、HSP90及HSP27的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。進一步探討其相互作用的具體機制。
　　 目的：明確RNA干擾STUB1基因?qū)θ司铙w上皮細胞生長狀態(tài)的影響及對分子伴侶HSP70、HSP90、HSP

4、27表達的影響，探討STUB1在白內(nèi)障防治中的重要作用。
　　 方法：構(gòu)建1個針對STUB1基因的表達質(zhì)粒和3個不同靶序列的干擾質(zhì)粒(KD1，KD2，KD3)，共轉(zhuǎn)染293T細胞，36h后收集細胞總蛋白質(zhì)樣本，Westernblot檢測各實驗組STUB1蛋白的表達變化，篩選出具有最高干擾效率的靶序列，包裝成慢病毒載體；按不同的轉(zhuǎn)染條件，用陰性對照慢病毒預轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞系SRA01/04株(HLEC)，轉(zhuǎn)染后第4天激光共聚焦

5、生物顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確定最佳轉(zhuǎn)染條件；設(shè)定實驗分組：RNA干擾組，陰性對照組，空白對照組。按預實驗確定的最佳轉(zhuǎn)染條件將干擾慢病毒及陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染HLEC，倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后第1、5、10、15及20天細胞形態(tài)的變化，MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染后第1-6天及第10、15天各組間細胞生長活性的變化；收集轉(zhuǎn)染后第5、10天的各組總RNA樣本，Real-TimePCR檢測各組的STUB1及分子伴侶HSP90，HSP70，HSP27的mRNA

6、水平的變化；收集轉(zhuǎn)染后第5、10、15、20天的各組總蛋白樣本，WesternBlot檢測各組的STUB1及分子伴侶HSP90，HSP70，HSP27的蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04株)，并可長期穩(wěn)定表達其攜帶的外源性基因，KD1序列具有最佳干擾效率；轉(zhuǎn)染后第1、5天各實驗組的細胞形態(tài)無明顯變化，第10天RNA干擾組及陰性對照組的HLEC變成梭狀，呈現(xiàn)纖維老化變形，以RNA

7、干擾組為甚。隨著時間推移，細胞變形現(xiàn)象明顯。MTT結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后第1-3天RNA干擾組的HLEC生長活性較陰性對照組有下降趨勢，第4-5天生長活性趨于穩(wěn)定，而第6-15天HLEC生長活性受到抑制，但隨時間推移細胞的生長活性逐漸恢復。Real-TimePCR結(jié)果顯示：RNA干擾STUB1基因后第5天，STUB1和HSP70的mRNA水平分別較陰性對照組下降了5.12倍和4.24倍，均具有統(tǒng)計學差異。RNA干擾后第10天，STUB1的mR

8、NA水平較陰性對照組下降了5.88倍，具有統(tǒng)計學差異；HSP70、HSP27和HSP90均無明顯下降，甚至較陰性對照組有所增加。WesternBlot結(jié)果顯示：STUB1在干擾后第5、10、15、20天蛋白含量明顯減少；HSP70第5、10天蛋白水平均減少；HSP27第5、15天蛋白水平下降，而第10、20天無明顯變化；HSP90在第10天減少，第5、15、20天無明顯變化。
　　 結(jié)論：RNA干擾HLEC的STUB1基因可引起