人原發(fā)性肝癌組織中干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞的分離鑒定及差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞在許多方面具有相似之處：它們都具有“未分化”的細(xì)胞表型；干細(xì)胞具有遷移特性，而癌細(xì)胞有轉(zhuǎn)移的能力；干細(xì)胞與癌細(xì)胞在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)化等。此外，已知腫瘤的發(fā)生需要經(jīng)歷多次的突變，與已分化的終末期功能細(xì)胞相比，干細(xì)胞更容易積累多次突變的轉(zhuǎn)化效應(yīng)。這些現(xiàn)象表明腫瘤可能起源于干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)急性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞中能分離出與骨髓造血干細(xì)胞具有相同干細(xì)胞表面標(biāo)志的癌細(xì)胞，這些細(xì)胞能在免疫缺陷小鼠中誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞樣白血病的發(fā)生;

2、這表明腫瘤組織中可能存在既具有自我增殖和自我更新特征，又具有腫瘤形成能力的腫瘤干細(xì)胞。目前已在多種惡性實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細(xì)胞的存在，例如乳腺癌、腦腫瘤等。原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)理的研究表明，肝臟中具有肝祖細(xì)胞特征的卵圓細(xì)胞參與了肝癌的發(fā)生;肝癌組織的異質(zhì)性表明，并不是每個(gè)肝癌細(xì)胞都具有行成腫瘤的能力，肝癌細(xì)胞之間在耐藥性上也有巨大的差異，這提示肝癌組織中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌細(xì)胞，分離和鑒定這群

3、細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特征對(duì)闡明肝癌發(fā)病機(jī)理、揭示肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要的意義，并為治療肝癌提供一個(gè)新的策略。 Hoechst/FACS是新近發(fā)現(xiàn)的一種能高效富集干細(xì)胞的方法，該方法的基本原理是利用了干細(xì)胞對(duì)染料具有排斥性這一特異性功能標(biāo)志，目前已知所有的干細(xì)胞能通過細(xì)胞表面的ABC載體將進(jìn)入胞內(nèi)的熒光染料Hoechst33342主動(dòng)外泵至胞外，這些染色后的干細(xì)胞在紫外光激發(fā)下，表現(xiàn)為低熒光的特征，在流式細(xì)胞儀上對(duì)Hoechs

4、t熒光進(jìn)行雙波長(zhǎng)分析發(fā)現(xiàn)，這些低熒光的干細(xì)胞表現(xiàn)為邊緣性聚集，將這些邊緣細(xì)胞群分選即可達(dá)到富集和分離干細(xì)胞的目的，該方法首先在分離骨髓造血干細(xì)胞上獲得了成功，隨后的研究表明，利用該方法可以從多種組織中高效、快速地分離得到成體干細(xì)胞。 目的：利用Hoechst/FACS分離和鑒定人原發(fā)性肝癌組織中具有干細(xì)胞特征的肝癌細(xì)胞，并利用抑制性消減雜交技術(shù)分析和篩選這些干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因。 方法： 1.機(jī)械分離結(jié)

5、合膠原酶消化法從人原發(fā)性肝癌組織中分離和制備肝癌細(xì)胞懸液； 2.肝癌細(xì)胞爬片后，用一定濃度的Hoechst33342在37℃對(duì)肝癌細(xì)胞染色90分鐘，固定細(xì)胞后，以小鼠抗人的BCRP單克隆抗體作為一抗，TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，封片后，在免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果; 3.肝癌細(xì)胞懸液等分為兩組，一組單純用Hoechst33342進(jìn)行染色，另一組同時(shí)加入鈣通道拮抗劑和相同濃度的Hoech

6、st染料，兩組細(xì)胞均染色90分鐘，然后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞中的Hoechst熒光，通過使用雙色性反射濾鏡和不同的組合濾片將每個(gè)肝癌細(xì)胞中熒光信號(hào)分為兩個(gè)部分-Hoechst蘭光部分和Hoechst紅光部分，采集這些光信號(hào)，并利用流式細(xì)胞軟件形成二維散點(diǎn)圖，分析兩組肝癌細(xì)胞在二維散點(diǎn)圖上的形態(tài)，通過設(shè)定“門”找出肝癌組織中的邊緣群細(xì)胞，并對(duì)比兩組肝癌細(xì)胞在邊緣群上的不同； 4.用PE標(biāo)記的小鼠抗人CD34、cy5標(biāo)記的小鼠抗人

7、c-kit以及FITC標(biāo)記的小鼠抗人sca-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)邊緣群肝癌細(xì)胞中三種干細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)情況; 5.將分選得到的SP表型肝癌細(xì)胞和非SP表型肝癌細(xì)胞分別在加有HGF的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的狀況；同時(shí)將這兩種表型的肝癌細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)，觀察克隆形成并計(jì)算克隆形成率；將這兩種在體外培養(yǎng)2周后的不同表型的肝癌細(xì)胞重新用Hoechst33342染色，并用流式細(xì)胞儀

8、檢測(cè)是否邊緣群仍然存在，以此來鑒定這兩種肝癌細(xì)胞是否具有自我更新能力； 6.分別將2×104的SP表型肝癌細(xì)胞和非SP表型的肝癌細(xì)胞在裸鼠皮下接種，對(duì)比觀察兩組肝癌細(xì)胞在裸鼠皮下形成移植瘤的能力； 7.將分選得到的SP表型肝癌細(xì)胞和正常肝組織分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，將SP表型肝癌細(xì)胞的cDNA作為檢測(cè)方，正常肝組織cDNA作為驅(qū)動(dòng)方，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將檢測(cè)方分為兩組分別與不同的接頭分子進(jìn)行連接，將連接好

9、接頭的檢測(cè)方cDNA與過量的驅(qū)動(dòng)方cDNA進(jìn)行連續(xù)兩次消減雜交，雜交產(chǎn)物經(jīng)抑制性PCR和巢式PCR富集到差異表達(dá)的基因片斷，PCR產(chǎn)物通過T/A克隆連接到載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果登錄GeneBank進(jìn)行同源性對(duì)比分析； 結(jié)果： 1.免疫組化結(jié)果證實(shí)了肝癌細(xì)胞表面有BCRP的表達(dá)，但并非所有肝癌細(xì)胞都表達(dá)BCRP，部分BCRP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上具有增殖和分裂的特征

10、；熒光顯微鏡觀察Hoechst染色后的肝癌細(xì)胞顯示Hoechst染料均勻地分布在肝癌細(xì)胞的胞漿及核仁，此外使用不同波長(zhǎng)的濾光片均能觀察到Hoechst的熒光，表明Hoechst33342的散射光譜具有較寬的波長(zhǎng)范圍； 2.流式細(xì)胞儀的雙波長(zhǎng)熒光分析結(jié)果顯示在Hoechst熒光的二維散點(diǎn)圖上，有邊緣細(xì)胞群存在，該群細(xì)胞占整個(gè)肝癌細(xì)胞總數(shù)的5％左右，加入鈣通道拮抗劑后該群細(xì)胞明顯減少，位于邊緣部分的大部分肝癌細(xì)胞因低熒光的特征消失而

11、進(jìn)入到了主細(xì)胞群中，這表明肝癌細(xì)胞的這種SP表型與ABC載體的主動(dòng)外泵作用有關(guān)； 3.流式細(xì)胞檢測(cè)檢測(cè)到SP表型的肝癌細(xì)胞表面c-kit、Sca-1和CD34等干細(xì)胞標(biāo)志的最高表達(dá)率分別為67.3％、44.2％和7％，依據(jù)c-kit表達(dá)率，可以減少對(duì)邊緣群“門”設(shè)置中的非特異性； 4.分選得到的SP表型肝癌細(xì)胞在體外無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在軟瓊脂中有較高的克隆形成率，而非SP表型肝癌細(xì)胞在同樣的生長(zhǎng)條件下則生長(zhǎng)遲緩，軟

12、瓊脂培養(yǎng)中未見有明顯的細(xì)胞克隆形成，說明SP表型的肝癌細(xì)胞具有非常高的增殖潛能；用Hoechst33342對(duì)在體外培養(yǎng)2周后的SP表型肝癌細(xì)胞和非SP表型肝癌細(xì)胞再次進(jìn)行染色，并經(jīng)流式細(xì)胞分析，結(jié)果表明SP表型肝癌細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中可以通過增殖再次產(chǎn)生SP表型和非SP表型肝癌細(xì)胞，而非SP表型肝癌細(xì)胞在體外培養(yǎng)后不再包含有邊緣群細(xì)胞，這說明SP表型肝癌細(xì)胞具有自我更新的特征； 5.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與非SP肝癌細(xì)胞相比，SP

13、表型肝癌細(xì)胞具有很高的致瘤能力； 6.提取的總RNA純度高，無降解；電泳結(jié)果表明反轉(zhuǎn)錄后雙鏈cDNA的RsaⅠ酶切徹底；接頭連接效率檢測(cè)結(jié)果顯示＞40％的檢測(cè)方cDNA與接頭連接成功，消減雜交后的兩輪PCR結(jié)果表明成功富集到差異表達(dá)的基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆后，挑取到3個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序并經(jīng)同源性比對(duì)，確認(rèn)這三個(gè)基因片段分別為表皮膜蛋白2、熱休克蛋白70和Tg737基因。 結(jié)論：利用Hoechst/FACS可以從