應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與MR-1相互作用的蛋白及MR-1在大腸桿菌中的表達.pdf

1、該論文第一部分是應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)研究與MR-1蛋白相互作用的蛋白,并克隆它們的編碼基因.該研究采用美國科隆技術(shù)公司酵母雙雜交系統(tǒng)3中的酵母菌株AH109和pGBKT7誘餌載體（BD）.首先,將全長MR-1基因插入到BD載體pGBKT7中（含有GAL4 DNA-binding domain）構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒,并且確證誘餌質(zhì)粒單獨不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄.然后,用這個誘餌質(zhì)粒篩選人骨骼肌cDNA文庫（用pCAT2載體構(gòu)建,含有GAL4 Act

2、ivation domain）,并通過β-gal分析驗證,最終獲得了14個陽性AD質(zhì)粒,序列分析比較結(jié)果表明陽性AD質(zhì)粒中的cDNA片段分別編碼七個蛋白,其中三個與肌肉收縮相關(guān).第二部分是在大腸桿菌表達系統(tǒng)中將MR-1蛋白與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）融合表達,并對表達產(chǎn)物進行了分離純化的探討.將MR-1基因插入到表達載體pGEX-5X-1中構(gòu)建成表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21,通過IPTG誘導(dǎo)表達.經(jīng)過SDS-PAGE檢測和W